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摘要 [目的]研究不同作用因素对纳米TiO2 的光催化活性影响，为纳米TiO2光催化杀菌技术的开发与应用提供参考。[方法]以菌液初始浓度、光照强度和纳米TiO2浓度为主要变量因素，研究不同因素条件下纳米TiO2对鸡肉源微生物P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌作用效果。[结果]纳米TiO2浓度增加对P.fluorescens和M.caseolyticus的抑菌作用呈先升高后降低的趋势，最佳浓度值为0.4 g/L；增高光照强度，降低初始菌液浓度，纳米TiO2的光催化抑菌效果增强；相同试验条件下，纳米TiO2对P. fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌作用一致，对M.caseolyticus的抑菌率始终低于P.fluorescens。[结论]M.caseolyticus对纳米TiO2的光催化作用比P.fluorescens更加敏感。
关键词 纳米TiO2； 光催化抑菌；M.caseolyticus；P.fluorescens
中图分类号 S879.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）23-037-04
纳米抑菌包装是近几年新兴的包装技术，此技术以纳米材料的抑菌性为基础。纳米金属氧化物纳米TiO2、Fe2O3的抗菌性受到广泛关注，纳米TiO2在紫外光照下被激发产生活性，在常温常压下对微生物起作用。所以，开发光催化的纳米抗菌材料，将会对抗菌包装有重要意义。TiO2的光催化特点已经在污水处理[1]、半导体电极应用[1]和光降解有机污染物[2]中有研究报道。
假单胞菌属（Pseudomonas spp.）是引起腐败的主要菌属，广泛存在于腐败畜禽肉[3-5]及相关制品中。已有多项研究证明，鸡肉在冷冻有氧条件下贮藏主要以嗜冷菌的生长引起腐败，其中主要的腐败菌是假单胞菌，在其浓度达到108CFU/mL时发出典型的腐败气味[6]。据Arthur报道[7]，鸡肉中的腐败菌优势菌株以G-菌为主，只有少量的菌株属于G+菌，球状菌（Macrococcus spp.）是在鸡肉中被发现的阳性菌属之一，在鸭肉及其他禽肉中也有发现。目前，纳米TiO2对腐败鸡肉来源菌株的光催化抑菌作用研究较少。
纳米TiO2具有良好的光催化活性，在光照条件产生活性物质，活性物质与菌体作用，可引起细菌体发生变化，甚至死亡。不同的光照条件，对纳米材料的活性有影响，而关于纳米材料光催化抑菌的作用机理仍然存在争议，没有统一定论。
笔者主要研究光照条件下纳米TiO2对腐败鸡胴体中存在的革兰氏阴性菌和阳性菌不同菌属的抑制作用，以不同的光催化反应因素变化为主要因素，为开发适用于生鲜鸡肉的非热源杀菌包装技术提供理论基础和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料与主要试剂。
纳米TiO2：P-25，晶体比例（锐钛型∶金红石= 80∶20），粒子大小（20～30 nm），比表面积50 m2/g，购自Degussa公司；胰蛋白大豆肉汤（TSB）、胰蛋白大豆琼脂培养基（TSB），BD Bacton，Dickinson and Company，USA；磷酸盐缓冲液（PBS），Bio-Rad Laboratories Inc，CA，USA。
1.1.2 主要仪器。85-2 型单头磁力搅拌器，常州国华仪器有限公司；
飞利浦 365 nm 紫外线灯（8 W）、LUYOR-340紫外线光强度计，上海路阳仪器有限公司；
SW-CJ-1F型超净工作台，苏净集团苏州安泰公司； TGL-64 高速离心机，湖南湘仪仪器有限公司；
恒温摇床，上海世平仪器有限公司；恒温生化培养箱，上海一恒仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 鸡肉腐败菌分离。
菌种分离纯化方法参照Arthur等的方法从腐败鸡胴体中分离腐败菌[7]。屠宰后除去头、鸡爪子和内脏的未冷却新鲜鸡胴体，从屠宰线上取样放在无菌的塑料袋中，取样品放在干净的取样箱中，带回实验室。去掉鸡脖子，待鸡胴体冷却后将袋子口轻轻封住，保持塑料袋不会完全敞开即可，包装后一起放在4 ℃的冷库中放置自然腐败，10、14 d分别取样进行菌种分离。从4 ℃冷库中取出样品，将整只鸡胴体转移到新的无菌塑料袋中，加入200 mL 无菌0.1%的蛋白胨溶液，封闭塑料袋，将塑料袋一起放在振荡器中振荡2 min。取出全部液体作为分析样品。液体样品使用0.1%的无菌蛋白胨溶液进行梯度稀释，取100 μL进行平板涂布，在不同的培养基平板上培养。所用培养基种类：Fe 琼脂培养基、STAA培养基、Pseudomonas 琼脂培养基、Levine EMB 培养基、Staphylococcus 培养基，涂布之后在适宜温度下培养。培养结束后，从培养基上挑取单菌落进行划线培养，直至得到均匀的形状一致的单一菌落，然后再继续划线培养3次，得到菌落形态一致的菌落。挑取单一菌落使用MIDI Sherlock MICROBIAL Identification system （MIS） 进行菌株鉴定。同一种培养基使用多个平板作为平行样品，系统通过定性和定量分析细胞膜的脂肪酸，与数据库中已知菌株进行对比分析，判断得出细菌的菌株类型。鉴定出的菌株分别进行菌种保藏，备用。 1.2.2 纳米TiO2光催化抑菌反应装置。
光催化抑菌反应试验采用自制光催化装置在密闭箱体中进行。反应装置主要有磁力搅拌器、紫外灯和无菌烧杯组成，反应溶液与催化剂加入无菌烧杯中，无菌烧杯放在磁力搅拌器上，用紫外灯（UVA）从上面垂直照射，光照强度根据试验需要进行设定调节，光照强度使用数显照度计直接测定。
1.2.3 反应菌液制备。
用接种环分别挑取少量P.fluorescens和M.caseolyticus菌落接种至无菌胰蛋白大豆肉汤（TSB）中，分别在适宜温度下摇瓶培养24 h。取培养好的新鲜菌液50 mL，在6 500 r/min离心10 min，去掉上层液体培养基，用无菌PBS清洗菌体2次，保证彻底除去培养基。使用50 mL无菌PBS重新悬浮细菌体，菌悬液备用。
1.2.4 光催化抑菌试验。
纳米TiO2用无菌蒸馏水配成所需浓度的悬浮液，取45 mL纳米TiO2悬浮液与5 mL菌悬液至250 mL无菌烧杯中，然后将烧杯放在磁力搅拌器上，置于紫外灯下照射处理。处理过程中持续搅拌，每隔一段时间取样检测。
1.2.5 细菌菌落计数方法。
取出的样品用无菌PBS溶液进行10倍系列梯度稀释，选择相邻的3个梯度进行计数培养，计算菌落数量变化。
取100 μL系列稀释好的菌液在胰蛋白大豆培养基（TSA）进行涂布，涂布均匀的平板，置于适宜温度下培养一定时间（P.fluorescens和M.caseolyticus在37 ℃培养24 h），对平板上的菌落进行计数。
1.3 数据分析
该试验数据为重复数据的平均值，使用origin 9.0进行作图和数据分析，使用SAS 8.2 进行方差分析（ANOVA）及多方差检验（Tukey’s multiple range test， P<0.05）
2 结果与分析
2.1 TiO2浓度对P.fluorescens与M.casolyticus的光催化抑菌作用
由图1可见，纳米TiO2含量为0.2 g/L 时，对P.fluorescens的抑制作用显著低于M.caseolyticus（P< 0.05）。在150 min 内P.fluorescens的活菌菌落数量比值（C/C0）降低至～10-3，而M.caseolyticus的比值降低至10-7。纳米TiO2含量增加到0.4 g/L时，对2种细菌的抑制效果都增强，对P.fluorescens的抑制作用明显低于M.caseolyticus（P<0.05）。150 min时，P.fluorescens的活菌菌落数量比值（C/C0）低于10-4，而M.caseolyticus的比值在90 min时低于10-5。TiO2含量增加到0.8 g/L时，对2种菌株间的光催化抑菌效果差异显著（P< 0.05），但低于0.4 g/L 时的效果。150 min 时P.fluorescens的活菌浓度比值降至10-4，而M.caseolyticus的值（C/C0）在90 min时已低于10-4。
不同浓度TiO2在试验过程中都可以显著抑制M.caseolyticus的生长（P< 0.05），导致其浓度快速降低，150 min 内不同浓度的TiO2都能杀死全部M.caseolyticus的生长。当浓度为0.2 g/L时，TiO2的作用效果最弱，120 min时使M.caseolyticus浓度降低至2.26 log，全部杀死细菌需要150 min。当浓度从0.2 g/L增加至0.4 g/L时，TiO2抑制全部M.caseulyticus生长的时间从150 min缩短至120 min。当浓度增大至0.8 g/L 时，TiO2对细菌的作用不再继续增加，其作用效果与0.4 g/L时相似，到120 min时不再有细菌生长。表明在光照强度下，TiO2浓度对一定初始浓度的M.caseolyticus的抑制作用有适宜值。在0.2～0.8 g/L的范围内，不同浓度TiO2的作用呈先增强后减弱的趋势。
2.2 光照强度对TiO2抑菌作用
由图2可见，当光照强度为300 μW/cm2时，纳米TiO2对P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌速率呈现不同的下降速度，P.fluorescens的活菌数量比值（C/C0）降低缓慢，其数量比值显著高于M.caseolyticus（P<0.05）。150 min时，P.fluorescens的浓度值（C/C0）降至10-3，而M.caseolyticus的浓度值（C/C0）接近10-7。在0～30 min 时，二者的浓度值相近，从60 min开始，M.caseolyticus的浓度值快速下降，其降低速度显著高于P.fluorescens（P< 0.05）。在120～150 min 时，P.fluorescens的浓度降低速度缓慢。
当光照强度为400 μW/cm2时，P.fluorescens的浓度比值（C/C0）150 min后降低至10-4，从90 min开始浓度降低速度放缓。M.caseolyticus的浓度值在120 min时降低至10-7。当光照强度为500 μW/cm2时，TiO2对2种细菌的光催化效果增强，对M.caseolyticus的抑菌效果显著高于P.fluorescens（P < 0.05）。P.fluorescens的浓度比值在0～120 min 时快速下降，120～150 min时缓慢降低，150 min后浓度值低于10-5。M.caseolyticus的浓度值（C/C0）在0～90 min时下降快速，浓度低于10-6，而 90 min 时P.fluorescens的比值（C/C0）为10-3。 从上述3种因素的结果可以得出，相同条件下M.caseolyticus比P.fluorescens更容易被杀死，表现为其浓度比值快速减少，降低趋势比P.fluorescens更明显。相同条件下，TiO2对P.fluorescens和M.caseolyticus的抑菌作用存在差异。菌液初始浓度增加，TiO2对二者的作用差异时间延长。在相同试验条件下，P.fluorescens的生存能力比M.caseolyticus强，不同菌属（G-和G+）之间，细菌自身的差异可能是导致此种差异存在的主要因素。此外，也与菌体自身的修复或抵御外界环境变化的能力不同有关。
2.3 纳米TiO2对不同初始浓度P.fluorescens与M.casolyticus的光催化抑菌作用
由图3可见，当初始菌液浓度为107 CFU/mL时，相同试验处理条件下，纳米TiO2对P.fluorescens和M.caseolyticus的抑菌作用趋势。M.caseolyticus的初始浓度值虽略高于P.fluorescens，反应过程中M.caseolyticus的浓度降低速率快于P.fluorescens。30～150 min时，P.fluorescens的浓度值显著高于M.caseolyticus（P< 0.05）。90 min后M.caseoyticus的浓度降低至102 CFU/mL，而P.fluorescens的浓度在150 min 时仍为103 CFU/mL，120 min降低速率明显减弱。
当初始浓度为106 CFU/mL时，P.fluorescens和M.caseolyticus在150 min后检测不到活菌生长。60 min后，M.caseolyticus的浓度降至102 CFU/mL，而P.fluorescens的浓度仍高达104 CFU/mL，P.fluorescens的浓度在90 min后才降低至102 CFU/mL。在30～90 min时，P.fluorescens的浓度值显著高于M.caseolyticus（P< 0.05），90 min之后二者浓度无明显差异（P > 0.05）。
当菌液初始浓度为105 CFU/mL时，M.caseolyticus和P.fluorescens二者浓度都快速下降，在60 min内二者浓度都降至不可检测范围。30 min时，M.caseolyticus的浓度降至102 CFU/mL，而P.fluorescens的浓度为104 CFU/mL，显著高于M.caseolyticus（P< 0.05）。随后30 min，P.fluorescens的浓度快速将至可检测范围以下。
3 结论与讨论
TiO2光催化作用机制由在TiO2表面生成的自由基起作用，此作用受不同物理因素作用影响，如光照强度、TiO2用量、初始菌液浓度等[8]。该研究发现，G-和G+菌对所用的催化剂（TiO2），以及光催化影响因素的反应是一致的，再次证明G-和G+2种微生物的抑菌作用机制基本一致，受作用因素的影响情况相似，如催化剂含量和光照强度对2种微生
物的影响一致，此2种因素主要对·OH的产生起作用[9]。
光照强度不仅会影响光照过程中对菌体的作用，而且会影响光照结束后的作用，光照强度对P.fluorescens和M.caseolyticus的作用趋势一致，随着光照强度的升高，对2种菌株的作用增强。催化剂TiO2含量增加对2种细菌的作用都呈现出先增强后减弱的趋势，尽管2种菌株间的作用效果存在差异，M.caseolyticus比P.fluorescens更容易被杀死。
纳米TiO2光照下能够被激发，在表面产生活性自由基，自由基团对细菌体产生作用。根据Sunada等对于光催化机理的解释，在材料表面产生的活性氧自由基（ROS）首先对细胞的外膜产生一定程度的破坏，引起膜的通透性发生改变或者是破坏，导致更多的ROS 进入胞内膜引起细胞分解死亡[10]。因此，细菌的死亡是ROS对细胞壁膜的攻击作用的结果，这攻击作用是一系列的ROS攻击作用累积的结果[11]。同时，细胞数量多少对催化剂表面产生的活性自由基（ROS）间存在竞争关系[12]，细菌数量越多，竞争增强。
Van Grieken认为，尽管革兰氏阳性菌和阴性菌的结构不同，但是它们的光催化抑菌机理似乎是一致的[9]。革兰氏阴性菌细胞壁的肽聚糖层比阳性菌薄，但是其最外层的磷脂双分子层，使它们的抗氧化作用更加复杂[13]。有人认为革兰氏阴性菌外层的磷脂层更加致密，使其不易受到氢氧自由基等活性物质的攻击[14-17]。同时，革兰氏阳性菌具有厚细胞壁虽然不易受到氢氧自由基的攻击，但是缺少外层的磷脂层导致其内部的DNA类物质容易受到破坏，从而导致其更易于死亡[9]。相反，有人认为革兰氏阳性菌的细胞壁厚，需要更多量的氢氧自由基攻击才能完全破坏其细胞壁[18-22]，所以革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更不易被杀死。Chung等认为，E.coli阴性菌的细胞壁比较薄，保护作用相对弱从而易于被杀死[18]。
尽管G-和G+的细胞壁不同，G-的细胞壁要复杂得多[23]，因此，如果光催化是需要对细胞壁产生相同的总效果，G-需要更长的氧化时间和更多的催化剂，这种说法是G+（M.caseolyticus ）比G-（P.fluorescens）更容易被杀死的原因，此前已经有类似报道[24]。但有研究表明，光催化抑菌动力学结果显示G-比G+的更快，他们假设细胞壁结构没有发生明显的变化[18]。因此，光催化抑菌机理仍然存在一定争议。 纳米TiO2对P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌作用效果趋势相同，菌株间存在差异，但在150 min内，纳米TiO2使M.caseolyticus和P.fluorescens菌落数量分别减少7 log和4 log。光照强度增加200 μW/cm2时，纳米TiO2抑制同样数量细菌生长所需时间缩短了近60 min，纳米TiO2的最佳作用浓度为0.4 g/L。
参考文献
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关键词 纳米TiO2； 光催化抑菌；M.caseolyticus；P.fluorescens
中图分类号 S879.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）23-037-04
纳米抑菌包装是近几年新兴的包装技术，此技术以纳米材料的抑菌性为基础。纳米金属氧化物纳米TiO2、Fe2O3的抗菌性受到广泛关注，纳米TiO2在紫外光照下被激发产生活性，在常温常压下对微生物起作用。所以，开发光催化的纳米抗菌材料，将会对抗菌包装有重要意义。TiO2的光催化特点已经在污水处理[1]、半导体电极应用[1]和光降解有机污染物[2]中有研究报道。
假单胞菌属（Pseudomonas spp.）是引起腐败的主要菌属，广泛存在于腐败畜禽肉[3-5]及相关制品中。已有多项研究证明，鸡肉在冷冻有氧条件下贮藏主要以嗜冷菌的生长引起腐败，其中主要的腐败菌是假单胞菌，在其浓度达到108CFU/mL时发出典型的腐败气味[6]。据Arthur报道[7]，鸡肉中的腐败菌优势菌株以G-菌为主，只有少量的菌株属于G+菌，球状菌（Macrococcus spp.）是在鸡肉中被发现的阳性菌属之一，在鸭肉及其他禽肉中也有发现。目前，纳米TiO2对腐败鸡肉来源菌株的光催化抑菌作用研究较少。
纳米TiO2具有良好的光催化活性，在光照条件产生活性物质，活性物质与菌体作用，可引起细菌体发生变化，甚至死亡。不同的光照条件，对纳米材料的活性有影响，而关于纳米材料光催化抑菌的作用机理仍然存在争议，没有统一定论。
笔者主要研究光照条件下纳米TiO2对腐败鸡胴体中存在的革兰氏阴性菌和阳性菌不同菌属的抑制作用，以不同的光催化反应因素变化为主要因素，为开发适用于生鲜鸡肉的非热源杀菌包装技术提供理论基础和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料与主要试剂。
纳米TiO2：P-25，晶体比例（锐钛型∶金红石= 80∶20），粒子大小（20～30 nm），比表面积50 m2/g，购自Degussa公司；胰蛋白大豆肉汤（TSB）、胰蛋白大豆琼脂培养基（TSB），BD Bacton，Dickinson and Company，USA；磷酸盐缓冲液（PBS），Bio-Rad Laboratories Inc，CA，USA。
1.1.2 主要仪器。85-2 型单头磁力搅拌器，常州国华仪器有限公司；
飞利浦 365 nm 紫外线灯（8 W）、LUYOR-340紫外线光强度计，上海路阳仪器有限公司；
SW-CJ-1F型超净工作台，苏净集团苏州安泰公司； TGL-64 高速离心机，湖南湘仪仪器有限公司；
恒温摇床，上海世平仪器有限公司；恒温生化培养箱，上海一恒仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 鸡肉腐败菌分离。
菌种分离纯化方法参照Arthur等的方法从腐败鸡胴体中分离腐败菌[7]。屠宰后除去头、鸡爪子和内脏的未冷却新鲜鸡胴体，从屠宰线上取样放在无菌的塑料袋中，取样品放在干净的取样箱中，带回实验室。去掉鸡脖子，待鸡胴体冷却后将袋子口轻轻封住，保持塑料袋不会完全敞开即可，包装后一起放在4 ℃的冷库中放置自然腐败，10、14 d分别取样进行菌种分离。从4 ℃冷库中取出样品，将整只鸡胴体转移到新的无菌塑料袋中，加入200 mL 无菌0.1%的蛋白胨溶液，封闭塑料袋，将塑料袋一起放在振荡器中振荡2 min。取出全部液体作为分析样品。液体样品使用0.1%的无菌蛋白胨溶液进行梯度稀释，取100 μL进行平板涂布，在不同的培养基平板上培养。所用培养基种类：Fe 琼脂培养基、STAA培养基、Pseudomonas 琼脂培养基、Levine EMB 培养基、Staphylococcus 培养基，涂布之后在适宜温度下培养。培养结束后，从培养基上挑取单菌落进行划线培养，直至得到均匀的形状一致的单一菌落，然后再继续划线培养3次，得到菌落形态一致的菌落。挑取单一菌落使用MIDI Sherlock MICROBIAL Identification system （MIS） 进行菌株鉴定。同一种培养基使用多个平板作为平行样品，系统通过定性和定量分析细胞膜的脂肪酸，与数据库中已知菌株进行对比分析，判断得出细菌的菌株类型。鉴定出的菌株分别进行菌种保藏，备用。 1.2.2 纳米TiO2光催化抑菌反应装置。
光催化抑菌反应试验采用自制光催化装置在密闭箱体中进行。反应装置主要有磁力搅拌器、紫外灯和无菌烧杯组成，反应溶液与催化剂加入无菌烧杯中，无菌烧杯放在磁力搅拌器上，用紫外灯（UVA）从上面垂直照射，光照强度根据试验需要进行设定调节，光照强度使用数显照度计直接测定。
1.2.3 反应菌液制备。
用接种环分别挑取少量P.fluorescens和M.caseolyticus菌落接种至无菌胰蛋白大豆肉汤（TSB）中，分别在适宜温度下摇瓶培养24 h。取培养好的新鲜菌液50 mL，在6 500 r/min离心10 min，去掉上层液体培养基，用无菌PBS清洗菌体2次，保证彻底除去培养基。使用50 mL无菌PBS重新悬浮细菌体，菌悬液备用。
1.2.4 光催化抑菌试验。
纳米TiO2用无菌蒸馏水配成所需浓度的悬浮液，取45 mL纳米TiO2悬浮液与5 mL菌悬液至250 mL无菌烧杯中，然后将烧杯放在磁力搅拌器上，置于紫外灯下照射处理。处理过程中持续搅拌，每隔一段时间取样检测。
1.2.5 细菌菌落计数方法。
取出的样品用无菌PBS溶液进行10倍系列梯度稀释，选择相邻的3个梯度进行计数培养，计算菌落数量变化。
取100 μL系列稀释好的菌液在胰蛋白大豆培养基（TSA）进行涂布，涂布均匀的平板，置于适宜温度下培养一定时间（P.fluorescens和M.caseolyticus在37 ℃培养24 h），对平板上的菌落进行计数。
1.3 数据分析
该试验数据为重复数据的平均值，使用origin 9.0进行作图和数据分析，使用SAS 8.2 进行方差分析（ANOVA）及多方差检验（Tukey’s multiple range test， P<0.05）
2 结果与分析
2.1 TiO2浓度对P.fluorescens与M.casolyticus的光催化抑菌作用
由图1可见，纳米TiO2含量为0.2 g/L 时，对P.fluorescens的抑制作用显著低于M.caseolyticus（P< 0.05）。在150 min 内P.fluorescens的活菌菌落数量比值（C/C0）降低至～10-3，而M.caseolyticus的比值降低至10-7。纳米TiO2含量增加到0.4 g/L时，对2种细菌的抑制效果都增强，对P.fluorescens的抑制作用明显低于M.caseolyticus（P<0.05）。150 min时，P.fluorescens的活菌菌落数量比值（C/C0）低于10-4，而M.caseolyticus的比值在90 min时低于10-5。TiO2含量增加到0.8 g/L时，对2种菌株间的光催化抑菌效果差异显著（P< 0.05），但低于0.4 g/L 时的效果。150 min 时P.fluorescens的活菌浓度比值降至10-4，而M.caseolyticus的值（C/C0）在90 min时已低于10-4。
不同浓度TiO2在试验过程中都可以显著抑制M.caseolyticus的生长（P< 0.05），导致其浓度快速降低，150 min 内不同浓度的TiO2都能杀死全部M.caseolyticus的生长。当浓度为0.2 g/L时，TiO2的作用效果最弱，120 min时使M.caseolyticus浓度降低至2.26 log，全部杀死细菌需要150 min。当浓度从0.2 g/L增加至0.4 g/L时，TiO2抑制全部M.caseulyticus生长的时间从150 min缩短至120 min。当浓度增大至0.8 g/L 时，TiO2对细菌的作用不再继续增加，其作用效果与0.4 g/L时相似，到120 min时不再有细菌生长。表明在光照强度下，TiO2浓度对一定初始浓度的M.caseolyticus的抑制作用有适宜值。在0.2～0.8 g/L的范围内，不同浓度TiO2的作用呈先增强后减弱的趋势。
2.2 光照强度对TiO2抑菌作用
由图2可见，当光照强度为300 μW/cm2时，纳米TiO2对P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌速率呈现不同的下降速度，P.fluorescens的活菌数量比值（C/C0）降低缓慢，其数量比值显著高于M.caseolyticus（P<0.05）。150 min时，P.fluorescens的浓度值（C/C0）降至10-3，而M.caseolyticus的浓度值（C/C0）接近10-7。在0～30 min 时，二者的浓度值相近，从60 min开始，M.caseolyticus的浓度值快速下降，其降低速度显著高于P.fluorescens（P< 0.05）。在120～150 min 时，P.fluorescens的浓度降低速度缓慢。
当光照强度为400 μW/cm2时，P.fluorescens的浓度比值（C/C0）150 min后降低至10-4，从90 min开始浓度降低速度放缓。M.caseolyticus的浓度值在120 min时降低至10-7。当光照强度为500 μW/cm2时，TiO2对2种细菌的光催化效果增强，对M.caseolyticus的抑菌效果显著高于P.fluorescens（P < 0.05）。P.fluorescens的浓度比值在0～120 min 时快速下降，120～150 min时缓慢降低，150 min后浓度值低于10-5。M.caseolyticus的浓度值（C/C0）在0～90 min时下降快速，浓度低于10-6，而 90 min 时P.fluorescens的比值（C/C0）为10-3。 从上述3种因素的结果可以得出，相同条件下M.caseolyticus比P.fluorescens更容易被杀死，表现为其浓度比值快速减少，降低趋势比P.fluorescens更明显。相同条件下，TiO2对P.fluorescens和M.caseolyticus的抑菌作用存在差异。菌液初始浓度增加，TiO2对二者的作用差异时间延长。在相同试验条件下，P.fluorescens的生存能力比M.caseolyticus强，不同菌属（G-和G+）之间，细菌自身的差异可能是导致此种差异存在的主要因素。此外，也与菌体自身的修复或抵御外界环境变化的能力不同有关。
2.3 纳米TiO2对不同初始浓度P.fluorescens与M.casolyticus的光催化抑菌作用
由图3可见，当初始菌液浓度为107 CFU/mL时，相同试验处理条件下，纳米TiO2对P.fluorescens和M.caseolyticus的抑菌作用趋势。M.caseolyticus的初始浓度值虽略高于P.fluorescens，反应过程中M.caseolyticus的浓度降低速率快于P.fluorescens。30～150 min时，P.fluorescens的浓度值显著高于M.caseolyticus（P< 0.05）。90 min后M.caseoyticus的浓度降低至102 CFU/mL，而P.fluorescens的浓度在150 min 时仍为103 CFU/mL，120 min降低速率明显减弱。
当初始浓度为106 CFU/mL时，P.fluorescens和M.caseolyticus在150 min后检测不到活菌生长。60 min后，M.caseolyticus的浓度降至102 CFU/mL，而P.fluorescens的浓度仍高达104 CFU/mL，P.fluorescens的浓度在90 min后才降低至102 CFU/mL。在30～90 min时，P.fluorescens的浓度值显著高于M.caseolyticus（P< 0.05），90 min之后二者浓度无明显差异（P > 0.05）。
当菌液初始浓度为105 CFU/mL时，M.caseolyticus和P.fluorescens二者浓度都快速下降，在60 min内二者浓度都降至不可检测范围。30 min时，M.caseolyticus的浓度降至102 CFU/mL，而P.fluorescens的浓度为104 CFU/mL，显著高于M.caseolyticus（P< 0.05）。随后30 min，P.fluorescens的浓度快速将至可检测范围以下。
3 结论与讨论
TiO2光催化作用机制由在TiO2表面生成的自由基起作用，此作用受不同物理因素作用影响，如光照强度、TiO2用量、初始菌液浓度等[8]。该研究发现，G-和G+菌对所用的催化剂（TiO2），以及光催化影响因素的反应是一致的，再次证明G-和G+2种微生物的抑菌作用机制基本一致，受作用因素的影响情况相似，如催化剂含量和光照强度对2种微生
物的影响一致，此2种因素主要对·OH的产生起作用[9]。
光照强度不仅会影响光照过程中对菌体的作用，而且会影响光照结束后的作用，光照强度对P.fluorescens和M.caseolyticus的作用趋势一致，随着光照强度的升高，对2种菌株的作用增强。催化剂TiO2含量增加对2种细菌的作用都呈现出先增强后减弱的趋势，尽管2种菌株间的作用效果存在差异，M.caseolyticus比P.fluorescens更容易被杀死。
纳米TiO2光照下能够被激发，在表面产生活性自由基，自由基团对细菌体产生作用。根据Sunada等对于光催化机理的解释，在材料表面产生的活性氧自由基（ROS）首先对细胞的外膜产生一定程度的破坏，引起膜的通透性发生改变或者是破坏，导致更多的ROS 进入胞内膜引起细胞分解死亡[10]。因此，细菌的死亡是ROS对细胞壁膜的攻击作用的结果，这攻击作用是一系列的ROS攻击作用累积的结果[11]。同时，细胞数量多少对催化剂表面产生的活性自由基（ROS）间存在竞争关系[12]，细菌数量越多，竞争增强。
Van Grieken认为，尽管革兰氏阳性菌和阴性菌的结构不同，但是它们的光催化抑菌机理似乎是一致的[9]。革兰氏阴性菌细胞壁的肽聚糖层比阳性菌薄，但是其最外层的磷脂双分子层，使它们的抗氧化作用更加复杂[13]。有人认为革兰氏阴性菌外层的磷脂层更加致密，使其不易受到氢氧自由基等活性物质的攻击[14-17]。同时，革兰氏阳性菌具有厚细胞壁虽然不易受到氢氧自由基的攻击，但是缺少外层的磷脂层导致其内部的DNA类物质容易受到破坏，从而导致其更易于死亡[9]。相反，有人认为革兰氏阳性菌的细胞壁厚，需要更多量的氢氧自由基攻击才能完全破坏其细胞壁[18-22]，所以革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌更不易被杀死。Chung等认为，E.coli阴性菌的细胞壁比较薄，保护作用相对弱从而易于被杀死[18]。
尽管G-和G+的细胞壁不同，G-的细胞壁要复杂得多[23]，因此，如果光催化是需要对细胞壁产生相同的总效果，G-需要更长的氧化时间和更多的催化剂，这种说法是G+（M.caseolyticus ）比G-（P.fluorescens）更容易被杀死的原因，此前已经有类似报道[24]。但有研究表明，光催化抑菌动力学结果显示G-比G+的更快，他们假设细胞壁结构没有发生明显的变化[18]。因此，光催化抑菌机理仍然存在一定争议。 纳米TiO2对P.fluorescens和M.caseolyticus的光催化抑菌作用效果趋势相同，菌株间存在差异，但在150 min内，纳米TiO2使M.caseolyticus和P.fluorescens菌落数量分别减少7 log和4 log。光照强度增加200 μW/cm2时，纳米TiO2抑制同样数量细菌生长所需时间缩短了近60 min，纳米TiO2的最佳作用浓度为0.4 g/L。
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