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摘要 介绍在教学实验中分别采用SDS法和CTAB法对辣椒基因DNA进行提取的过程，结果表明，改进的CTAB法提取的DNA含量较高且纯度较好；同时发现在电泳检测过程中，恒定电流检测图像结果中呈现的基因组DNA条带要比恒定电压检测结果平整。
关键词 辣椒；DNA；电泳
中图分类号：G642.423 文献标识码：A 文章编号：1671-489X（2008）20-0127-02
DNA提取是进行分子生物学研究的第一步，也是大学生必须掌握的专业实验技能。现有的植物DNA提取方法很多，在教学过程中可根据材料本身特点的不同而选择不同的方法。目前使用较多的是SDS（十二烷基硫酸钠）法、CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法[1]，主要用于草本植物和不含酚类或含酚类较少的植物DNA提取。在辣椒基因组DNA提取过程中，由于叶片中富含的酚类物质可使DNA降解，也可与DNA结合形成沉淀物，严重影响DNA的提取效果[2-3]。本文以教学实验植物基因组DNA提取中SDS方法[4]为基础，然后利用改进的CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法提取辣椒基因组DNA与之进行比较，摸索适合辣椒基因组DNA提取的方法，以便更好地服务于实验教学。
1 材料与方法
1.1 实验材料以常规辣椒品种保加利亚尖椒幼嫩叶片为实验材料，采集新鲜叶片数片洗净后再用去离子水清洗2次，晾干，置于4 ℃冰箱冷藏室内备用。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
1）SDS（十二烷基硫酸钠）法见参考文献[4]。
2）CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法[5]。
①称取干燥新鲜叶片约0.4 g置于干净的研钵中，剪成小片，加液氮充分研磨约8 min，至粉末呈浅灰绿色即可。
②将磨碎的粉末等量分装于4个1.5 mL的微量离心管中，各加1 mL预热（约50 ℃）的2×CTAB缓冲液[含2% CTAB（Cetyltrimethy Ammonium Bromide，Sigma），1.4 mol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-Cl，pH8.0，0.2%β-巯基乙醇（V/M）]，充分摇匀。
③60 ℃保温1.5 h，每隔15 min～20 min摇匀一次。然后室温放置30 min，其间摇动1～2次。
④10 000 r/min离心5 min，弃沉淀，取上清液移至新管，加氯仿-异戊醇至满管，并用力摇匀。
⑤10 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液移至新管，加氯仿-异戊醇至满管，并用力摇匀。
⑥10 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液。先加1/10体积预冷（4 ℃）的3 mol/L NaAc，再加预冷（4 ℃）的异丙醇至新管，将离心管轻轻翻转几次（约5 s），-20 ℃放置2 h以上或过夜。
⑦10 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗脱2次，再用无水乙醇洗脱一次。晾干（或用灭菌过的滤纸吸干）后，加50 μL 1×TE溶液溶解。
⑧加入1 μL 10 mg/mL的RNase溶解DNA，30 ℃水浴或室温1 h去除RNA，置-20 ℃保存备用。
1.2.2 电泳检测在恒定电压（80 V）或恒定电流（80 mA）的条件下，取5 μL DNA加2 μL上样缓冲液，于1%的琼脂糖凝胶（含0.5 μg/μL EB）中电泳检测，用凝胶成像系统保存图像，通过带形分析来比较DNA的完整性等质量特点。
2 结果分析
如图所示，经SDS法、CTAB法提取辣椒基因组DNA均获得成功（图1、图2），但通过带形分析，等量DNA经电泳检测后亮度呈现不同，表明这两种方法提取的DNA总量有较大差别。由图2可知，CTAB法提取的DNA含量较高且纯度较好，能直接用于PCR、RAPD和RFLP等分子实验。
此外，在实验中还发现，恒定电流条件下DNA条带比恒定电压电泳结果平整，表明在此实验中恒定电流更适合于电泳检测。
3 讨论
DNA提取方法主要是采用破壁和破膜的方法，SDS、CTAB等去污剂均能够破坏细胞膜使蛋白质沉淀下来，从而释放DNA；同时在一定的盐浓度下，它们也可以沉淀色素和多糖。本研究表明，在富含酚类物质的辣椒叶片DNA提取过程中，改进的CTAB法提取的DNA含量较高且纯度较好，比SDS法好。所以在以后的实验教学过程中，一般应采用CTAB法，因为CTAB法不仅简便、快速，而且DNA产量高，适用于一般分子生物学操作。
在电泳过程中，将电泳仪调至水平，然后在恒定电压条件下进行电泳检测，多次DNA条带电泳结果均呈现一定程度的不平整现象。在采用CTAB法提取DNA后，采用恒定电流的条件进行电泳检测，结果大有改观。出现此现象的原因可能是在电泳过程中电泳液和凝胶温度不断升高，导致电阻变化，从而引起电流不稳定造成的。
通过研究表明，用改进的CTAB法提取植物基因组DNA，在恒流电泳的条件下DNA电泳检测更有利于植物基因组DNA提取的实验教学，可以进一步在实验中推广使用。
参考文献
[1]王关林,等.植物基因工程原理与技术[M].第二版.北京:科学出版社,2002,742-749
[2]Proberki S L, Bailey G, Baum R B. Modification of a CTAB extraction protocol for plant containinghigh polysaccharide and polyphenol components[J].Plant Mol Rep,1997(12):8-15
[3]王岩,等.辣椒叶片DNA提取方法的优化[J].长江蔬菜,2006,8:59-61
[4]魏群,等.分子生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,1999,69-70
[5]李建武,等.生物化学实验原理和方法[M].北京:北京大学出版社,2001,264-265
关键词 辣椒；DNA；电泳
中图分类号：G642.423 文献标识码：A 文章编号：1671-489X（2008）20-0127-02
DNA提取是进行分子生物学研究的第一步，也是大学生必须掌握的专业实验技能。现有的植物DNA提取方法很多，在教学过程中可根据材料本身特点的不同而选择不同的方法。目前使用较多的是SDS（十二烷基硫酸钠）法、CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法[1]，主要用于草本植物和不含酚类或含酚类较少的植物DNA提取。在辣椒基因组DNA提取过程中，由于叶片中富含的酚类物质可使DNA降解，也可与DNA结合形成沉淀物，严重影响DNA的提取效果[2-3]。本文以教学实验植物基因组DNA提取中SDS方法[4]为基础，然后利用改进的CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法提取辣椒基因组DNA与之进行比较，摸索适合辣椒基因组DNA提取的方法，以便更好地服务于实验教学。
1 材料与方法
1.1 实验材料以常规辣椒品种保加利亚尖椒幼嫩叶片为实验材料，采集新鲜叶片数片洗净后再用去离子水清洗2次，晾干，置于4 ℃冰箱冷藏室内备用。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
1）SDS（十二烷基硫酸钠）法见参考文献[4]。
2）CTAB（十六烷基三甲基溴化胺）法[5]。
①称取干燥新鲜叶片约0.4 g置于干净的研钵中，剪成小片，加液氮充分研磨约8 min，至粉末呈浅灰绿色即可。
②将磨碎的粉末等量分装于4个1.5 mL的微量离心管中，各加1 mL预热（约50 ℃）的2×CTAB缓冲液[含2% CTAB（Cetyltrimethy Ammonium Bromide，Sigma），1.4 mol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-Cl，pH8.0，0.2%β-巯基乙醇（V/M）]，充分摇匀。
③60 ℃保温1.5 h，每隔15 min～20 min摇匀一次。然后室温放置30 min，其间摇动1～2次。
④10 000 r/min离心5 min，弃沉淀，取上清液移至新管，加氯仿-异戊醇至满管，并用力摇匀。
⑤10 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液移至新管，加氯仿-异戊醇至满管，并用力摇匀。
⑥10 000 r/min离心10 min，弃沉淀，取上清液。先加1/10体积预冷（4 ℃）的3 mol/L NaAc，再加预冷（4 ℃）的异丙醇至新管，将离心管轻轻翻转几次（约5 s），-20 ℃放置2 h以上或过夜。
⑦10 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗脱2次，再用无水乙醇洗脱一次。晾干（或用灭菌过的滤纸吸干）后，加50 μL 1×TE溶液溶解。
⑧加入1 μL 10 mg/mL的RNase溶解DNA，30 ℃水浴或室温1 h去除RNA，置-20 ℃保存备用。
1.2.2 电泳检测在恒定电压（80 V）或恒定电流（80 mA）的条件下，取5 μL DNA加2 μL上样缓冲液，于1%的琼脂糖凝胶（含0.5 μg/μL EB）中电泳检测，用凝胶成像系统保存图像，通过带形分析来比较DNA的完整性等质量特点。
2 结果分析
如图所示，经SDS法、CTAB法提取辣椒基因组DNA均获得成功（图1、图2），但通过带形分析，等量DNA经电泳检测后亮度呈现不同，表明这两种方法提取的DNA总量有较大差别。由图2可知，CTAB法提取的DNA含量较高且纯度较好，能直接用于PCR、RAPD和RFLP等分子实验。
此外，在实验中还发现，恒定电流条件下DNA条带比恒定电压电泳结果平整，表明在此实验中恒定电流更适合于电泳检测。
3 讨论
DNA提取方法主要是采用破壁和破膜的方法，SDS、CTAB等去污剂均能够破坏细胞膜使蛋白质沉淀下来，从而释放DNA；同时在一定的盐浓度下，它们也可以沉淀色素和多糖。本研究表明，在富含酚类物质的辣椒叶片DNA提取过程中，改进的CTAB法提取的DNA含量较高且纯度较好，比SDS法好。所以在以后的实验教学过程中，一般应采用CTAB法，因为CTAB法不仅简便、快速，而且DNA产量高，适用于一般分子生物学操作。
在电泳过程中，将电泳仪调至水平，然后在恒定电压条件下进行电泳检测，多次DNA条带电泳结果均呈现一定程度的不平整现象。在采用CTAB法提取DNA后，采用恒定电流的条件进行电泳检测，结果大有改观。出现此现象的原因可能是在电泳过程中电泳液和凝胶温度不断升高，导致电阻变化，从而引起电流不稳定造成的。
通过研究表明，用改进的CTAB法提取植物基因组DNA，在恒流电泳的条件下DNA电泳检测更有利于植物基因组DNA提取的实验教学，可以进一步在实验中推广使用。
参考文献
[1]王关林,等.植物基因工程原理与技术[M].第二版.北京:科学出版社,2002,742-749
[2]Proberki S L, Bailey G, Baum R B. Modification of a CTAB extraction protocol for plant containinghigh polysaccharide and polyphenol components[J].Plant Mol Rep,1997(12):8-15
[3]王岩,等.辣椒叶片DNA提取方法的优化[J].长江蔬菜,2006,8:59-61
[4]魏群,等.分子生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,1999,69-70
[5]李建武,等.生物化学实验原理和方法[M].北京:北京大学出版社,2001,264-265