【摘 要】
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目的构建带有黄色荧光蛋白突变体Venus标签的食欲素2型受体(Orexin type 2 receptor,OX2R)点突变的真核表达载体,拟用于后续明确突变位点在OX2R介导的信号通路中的作用。方法
【机 构】
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曲阜师范大学,济宁医学院神经生物学研究所
【基金项目】
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山东省自然基金项目(ZR2013CQ031,ZR2015CL021)
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目的构建带有黄色荧光蛋白突变体Venus标签的食欲素2型受体(Orexin type 2 receptor,OX2R)点突变的真核表达载体,拟用于后续明确突变位点在OX2R介导的信号通路中的作用。方法先根据OX2R的基因序列设计带有点突变及酶切位点(Hind Ⅲ和Bam HI)的特异性引物,然后利用聚合酶链式反应(PCR)技术,以Human OX2R为模板,构建OX2R的突变体。用Hind Ⅲ和Bam HI对产物及质粒pVenus-N1进行双酶切,然后回收,连接,转化,获得重组的突变体质粒。并对重组质粒进行酶切与测序鉴定。最后将突变质粒转染HEK293T细胞,利用超高分分辨率显微镜观察突变质粒的表达及定位。结果 PCR扩增到预期的目的基因片段,酶切与测序结果显示OX2R的突变载体构建成功。超高分分辨率显微镜观察到突变质粒与野生质粒均可在HEK293T细胞膜上表达。结论成功构建了OX2R点突变的表达载体,为进一步研究OX2R的关键位点及针对OX2R新药的开发奠定了基础。
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