【摘 要】
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通过优化LAMP反应体系中镁离子、甜菜碱、dNTP等反应组成成分,而后进行特异性试验,并优化钙黄绿素与氯化锰的比例放入LAMP体系内,最后应用LAMP检测含有小肠结肠炎耶尔森氏菌(
【机 构】
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江苏农林职业技术学院畜牧兽医学院,江苏句容212400;句容市农业农村局,江苏句容212400;吉林大学人兽共患病研究所,吉林长春130062
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通过优化LAMP反应体系中镁离子、甜菜碱、dNTP等反应组成成分,而后进行特异性试验,并优化钙黄绿素与氯化锰的比例放入LAMP体系内,最后应用LAMP检测含有小肠结肠炎耶尔森氏菌(耶氏菌)的肉品,从而建立一种能够检测耶氏菌并通过肉眼观察和判断试验结果的LAMP方法.结果 显示,优化的25 μL反应体系如下:9 mmol/L Mg2+、1.8 mmol/L dNTPs、1.0 mol/L betaine、0.2 μ mol/L外引物、0.8μmol/L内引物、1 μL Bst DNA polymerase(8 U/μL)、2.5 μL 10×thermpol reaction buffer、228 μmol/L钙黄绿素、324 μmol/L氯化锰,反应温度65℃孵育60 min.LAMP检测耶氏菌基因组DNA的最低检测限是85.3×101ng/μL,比文献PCR方法灵敏性高出2个数量级.LAMP方法对耶氏菌gDNA的最低检测限对应的基因拷贝数最低检测限是35,对应的CFU最低检测限是7×102 CFU/mL.本试验建立的这种可视化的检测耶氏菌的LAMP方法,为耶氏菌的检测提供了一种新的参考.
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