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摘 要 为获得高产重组人血清白蛋白的转基因紫花苜蓿“游客”（Medicago sativa L. cv. ‘Eureka’）株系用于规模化生产rHSA，构建了rHSA植物表达载体。以紫花苜蓿子叶愈伤组织为受体，通过农杆菌介导法进行遗传转化，筛选出潮霉素抗性植株，提取抗性再生紫花苜蓿植株基因组DNA做PCR鉴定，结果表明重组人血清白蛋白基因片段已整合到紫花苜蓿基因组中；提取转基因植株总蛋白，Western blotting检测结果表明rHSA在转基因植株中成功表达。此结果表明转基因紫花苜蓿可稳定表达rHSA。
关键词 重组人血清白蛋白；紫花苜蓿；农杆菌；转基因
中图分类号 Q786；R977.8 文献标识码 A
Abstract Human serum albumin （HSA） is the most abundant protein in human plasma， and is widely used in clinical practice and biopharmaceutical industry. Gene-recombinant HSA （rHSA） is an ideal substitute of plasma-derived HSA at present. In order to make high-yielding transgenic Medicago sativa L. cv. ‘Eureka’ for industrial production of rHSA， an expression vector was constructed using a modified pCAMBIA1300 plasmid， and the expression vector constructed was transferred into the cotyledon callus of the plant by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. After selection of hygromycin-resistant plants， the genomic DNA of the regenerated transgenic plant was extracted for PCR， and the results indicated that the rHSA gene was integrated into the genome of M. sativa L. In addition， total proteins of the transgenic plants were extracted and tested by Western blotting， and the results showed that rHSA was successfully expressed in the plants. The study confirmed that rHSA could be expressed steadily in transgenic Medicago sativa L. and it laid a foundation for further study on separation and purification of rHSA from transgenic Medicago sativa L.
Key words recombinant human serum albumin； Medicago sativa L. cv. Eureka； Agrobacterium tumefaciens； transgene
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.017
人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人血漿中主要的蛋白质，约占血浆总蛋白的60%。HSA的主要生理功能是维持血液胶体渗透压、结合并运输内源性及外源性物质[1]，临床上用于烧伤或严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒、肾病综合征、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂等，也可作为血浆增溶剂[2]。血浆白蛋白每下降2.5 g/L，死亡危险性增加24%～56%[3]；血浆白蛋白水平<20 g/L，患者死亡率几乎是100%[4]。在制药领域，HSA广泛用作保护剂、稳定剂和赋形剂等。目前，HSA全球年销售量超过600 t，与实际850 t的需求相比，约有250 t的年缺口[5]。临床使用的HSA主要通过人体血液提取，受人血来源不足和血源传染病的影响，供应相对紧张[6]。因此，重组人血清白蛋白的生产作为一种获得大量无病原的HSA的替代方法越来越受到重视。
在过去的几十年里，对于rHSA的表达研究已经涉及细菌、酵母、转基因动物和转基因植物等多种表达系统[7]。1981年，Lawn等[8]首次实现了HSA基因在大肠杆菌中的表达，表达量可达2.5 g/L。目前应用最多的是酵母表达体系，日本三菱公司采用AOX2启动子，通过补料分批培养，使rHSA在毕赤酵母中的表达量提高到10 g/L[9]。在临床医学应用中，HSA的用量较大，成年人每日最低剂量可达5～10 g，现有微生物表达系统的生产规模无法满足需要。与其他表达系统相比，动物生物反应器生产的rHSA 可进行转录后修饰，具有表达量高、生物活性好、不污染环境等优点。在转基因动物表达体系中，已有研究表明rHSA在转基因小鼠[10]、转基因牛的乳腺细胞[11]以及转基因蚕丝内[12]均成功表达。与其他的生物反应器相比，植物生物反应器所表达的外源蛋白质可完整地完成转录后修饰、折叠等过程，能表达出具有生物活性的功能蛋白。此外，植物生物反应器易于大规模生产外源蛋白，植物的田间种植和管理比其他系统更加低廉、有效，生产成本和管理投资等相比其他表达体系有很大的优势，并且不存在血源性病原体污染等风险。利用植物转基因表达rHSA的研究在转基因烟草[13]、马铃薯块茎[14]、水稻细胞悬浮培养[15]等受体中获得了成功。杨代常等[16]利用水稻胚乳表达的rHSA占糙米中可溶性蛋白总量的10.58%，表达量为2.75 g/kg，但是水稻本身的生产周期限制了 rHSA的生产。由于微生物发酵规模和植物生长周期等的限制，以及转基因动物制备rHSA存在传播疾病的潜在风险，到目前为止，进入工业化生产的rHSA主要来源于酵母和转基因水稻等，其制备的rHSA主要用作培养基或者制剂辅料，仍然不能满足临床用药需求。 紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种广泛种植的豆科多年生牧草，本身不具毒性[17]。它具有高营养、适应力强、适口性好等特点[18]，其蛋白含量一般在18%以上。此外，它的再生能力强，一年可以收割多次，能连续多年高产，是表达外源蛋白的理想受体材料[19]。近年来以紫花苜蓿作为生物反应器表达外源蛋白已取得一定进展[20-24]。本研究构建rHSA植物表达载体，采用农杆菌介导法将其基因转入紫花苜蓿中，并在转基因紫花苜蓿中成功表达，为利用转基因紫花苜蓿生产rHSA奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
紫花苜蓿选育品种“游客”（Medicago sativa L. cv. ‘Eureka’），购于百绿（天津）国际草业有限公司。
农杆菌株GV3101、质粒pCAMBIA1300均为本实验室保存。质粒pGEM-ALB购自上海权阳生物科技有限公司。Dzup基因组DNA抽提试剂盒购于上海生工（产品编号B518203）。限制性内切酶KpnⅠ/SalⅠ购于NEB公司。T4连接酶、DNA聚合酶购于Takara公司。植物生长激素购于北京索莱宝科技有限公司。VE386半干转移电泳槽购自Tanon公司。Rabbit Anti-Serum albumin购自Bioss公司，货号bs-0945R。Goat Anti-Rabbit IgG H&L （Alexa Fluor? 647）购自abcam公司，货号：ab150079。
1.2 方法
1.2.1 基因重组人血清白蛋白全长cDNA的克隆 根据已公布的人血清白蛋白基因CDS序列（NCBI Reference Sequence：NM_000477.5）设计HSA基因全长cDNA引物，在引物两端加上KpnⅠ/SalⅠ酶切位点，在5’端起始密码子前引入Kazak序列（5’-GCCACC-3’），引物为ALB-F（5’-CGGGGTACCGCCACCATGGATGCACACAAG-3’），ALB-R（5’-CGCGTCGACTTATTATTATAAGCCTAAGGC-3’）。
以人血清白蛋白中间质粒pGEM-ALB为模板，用特异性引物ALB-F、ALB-R进行PCR扩增，PCR反应条件为：98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳并回收，得到HSA全长序列。
1.2.2 表达载体的构建 将HSA扩增回收产物和pCAMBIA1300质粒分别用限制性内切酶KpnⅠ和SalⅠ酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后回收酶切产物。用T4连接酶将酶切产物于4 ℃连接过夜，将连接产物转入大肠杆菌DH5α得到的重组质粒，用限制性内切酶KpnⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定并测序，最终得到HSA基因序列插入质粒pCAMBIA1300的KpnⅠ和SalⅠ位点之间的重组质粒，即重组人血清白蛋白植物表达载体pCAMBIA1300-HSA。HSA基因由CAMV35s启动子控制，至Tnos转录终止（图1）。
1.2.3 农杆菌介导的紫花苜蓿转化及转基因植株的获得 采用电击法（Bio-Rad MicroPulser电穿孔仪，型号：1652100）将构建好的重组质粒pCAMBIA1300-HSA转入农杆菌GV3101感受态细胞中，28 ℃培養，经单菌落PCR鉴定获得阳性转基因工程菌。将阳性单克隆单菌落扩大培养用于紫花苜蓿的转化。紫花苜蓿的转化参考Liu等 [25]的方法进行。农杆菌转化菌液与紫花苜蓿愈伤组织共培养后，用25 mg/L的潮霉素进行抗性筛选，筛选得到的抗性愈伤组织经诱导分化、生根获得转基因组培苗。经炼苗后，将转基因组培苗移至土壤中自然条件培养。
1.2.4 转基因植株的鉴定 取转基因植株的叶片用液氮研磨成粉末，用Dzup基因组DNA抽提试剂盒进行抽提，提取液经氯仿抽提、无水乙醇沉淀、75%乙醇漂洗后晾干。用无菌双蒸水溶解沉淀得到转基因紫花苜蓿基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，用引物ALB-F、ALB-R进行PCR扩增，PCR结果呈阳性的即为阳性转基因紫花苜蓿植株。对基因检测为阳性的植株进行蛋白质提取，将叶片组织用液氮冷冻，每克组织中加入3 mL蛋白提取缓冲液[0.1 mol/L Tris-HCl，10 mmol/L MgCl2，18%（w/V）蔗糖，40 mmol/L β-巯基乙醇，pH 8.0]，研钵中充分研磨后用纱布过滤，离心得到的上清即为蛋白质粗提液。样品经10% SDS-PAGE凝胶电泳后用半干转移电泳槽进行转膜，25 V，4 mA/cm2转印1 h至硝酸纤维素膜上，将膜于室温封闭2 h后放在含HSA一抗（Rabbit anti-serum albumin）的稀释液中4 ℃孵育过夜；用TBST缓冲液洗膜3次（每次10 min）后，避光室温孵育二抗[Goat anti-rabbit IgG H&L （Alexa Fluor? 647）] 2 h，再用TBST缓冲液洗膜3次后用Typhoon FLA 9500扫膜。Western blotting检测结果呈阳性的即为成功表达rHSA的转基因紫花苜蓿植株。
2 结果与分析
2.1 HSA基因 cDNA的克隆与表达载体的构建
以人血清白蛋白中间质粒pGEM-ALB为模板，用特异性引物ALB-F、ALB-R进行PCR扩增，获得约1 760 bp的片段（图2）。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳并回收，得到HSA全长序列。HSA PCR扩增产物和pCAMBIA1300质粒分别用KpnⅠ和SalⅠ酶切，酶切产物用T4连接酶连接后转入大肠杆菌DH5α得转化子，提取重组质粒，用KpnⅠ和SalⅠ双酶切检测，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，得到1 760 bp左右的小片段和10 000 bp左右的大片段，分别与HSA基因片段和pCAMBIA1300质粒所作对照的条带保持一致（图3）。将重组质粒送上海生工进行测序，结果表明该质粒为HSA基因序列插入pCAMBIA1300质粒的KpnⅠ和SalⅠ位点间得到的重组质粒，即rHSA植物表达载体pCAMBIA1300-HSA。 2.2 农杆菌介导的紫花苜蓿转化
采用电击法将构建好的重组质粒pCAMBIA1300-HSA转入农杆菌GV3101感受态中，28 ℃培养，经单菌落PCR鉴定获得阳性转基因工程菌，菌落PCR结果见图4。
紫花苜蓿“游客”种子经2%（有效氯含量）次氯酸钠溶液表面消毒5 min，接种至1/2 MS培养基萌发生长5 d。分离无菌子叶至愈伤组织培养基上诱导愈伤组织的形成，继代培养20～30 d后可得到淡黄色的胚性脆性愈伤组织，选取生长状态良好的愈伤组织分离成直径0.5 cm的细胞团用于转化。用农杆菌重悬液（OD600=0.6）浸染愈伤组织2 min后共培养2～3 d，将转染后的紫花苜蓿愈伤组织转移至含有潮霉素25 mg/L和头孢噻肟钠500 mg/L的筛选培养基中筛选培养，20 d左右大部分愈伤组织褐化死亡。将具有Hyg抗性的愈伤组织继代培养，选择生长状态良好的愈伤组织进行诱导分化培养，培养4～5周后愈伤组织分化形成翠绿色的胚芽，继续培养至形成幼苗。诱导幼苗形成不定根，培养至形成发达根系，将无菌组培苗炼苗后移栽至室外自然条件下生长，其转化过程见图5。
2.3 转基因植株的鉴定
转化筛选获得26株再生植株，以Dzup基因组DNA抽提试剂对转基因植株的叶片进行基因组DNA抽提，以提取的基因组DNA为模板，用引物ALB-F、ALB-R进行PCR扩增，部分植株对应的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示。其中阳性对照为质粒pCAMBIA1300-HSA，阴性对照为野生型紫花苜蓿“游客”基因组DNA。泳道1～8获得了与阳性对照大小一致的约为1 760 bp的条带，确定为阳性转基因植株。
对部分基因检测为阳性的植株进行蛋白质提取，将样品于10% SDS-PAGE电泳后进行Western blotting检测，结果见图7。阳性对照为血源性人血清白蛋白，阴性对照为野生型紫花苜蓿“游客”蛋白粗提物。样品1～7均呈阳性，即成功表达rHSA的转基因紫花苜蓿植株。
3 讨论
1986年，Deak等[26]首次实现了苜蓿转基因体系的建立，证明了通过转基因技术改良紫花苜蓿的可行性。随后，针对紫花苜蓿转基因的研究越来越多，除生物反应器以外，还涉及抗非生物胁迫[27-28]、抗生物胁迫[29-30]和品质改良[31-32]等方面。紫花苜蓿蛋白含量高，含多种矿物元素、维生素等，在农牧业中发挥着重要的作用。紫花苜蓿作为优质牧草，其生物安全性有保障。本研究通过农杆菌介导法将HSA基因导入紫花苜蓿细胞中，经诱导获得转基因植株。基因组DNA的PCR检测和Western blotting检测结果表明rHSA在转基因紫花苜蓿中成功表达。到目前为止，多种rHSA表达体系的表达量都相对较低，由于生物的个体差异，转基因植株对于外源蛋白的表达量会有所不同，笔者会着眼于筛选出具有高表达量的转基因受体植株，以期为后续的研究打好基础。
对于高效利用转基因紫花苜蓿规模化生产rHSA，除了分子水平的优化和改进，还应该注重转基因紫花苜蓿的种植和管理，以便提高产量。紫花苜蓿分枝数和植株高度是影响其产量和品质的主要因素。王彦华等[33]研究发现适当减少播种量可以提高植株高度。王茜等[34] 的研究表明土壤水分和施氮水平具有显著的互作效应。在缺水的地區或季节，施肥与灌溉应同步进行；在含水量较高的地区，适当增施氮肥有利于紫花苜蓿高产。紫花苜蓿一年可刈割多次，刈割时留茬高度对苜蓿的再生和产量有显著影响。王坤龙等[35]通过测定不同留茬高度对苜蓿根系生长、储藏性营养物质含量和返青率的影响，发现随着留茬高度的增加，主根直径、根干重和侧根总数均增加。所以，适当地增加留茬高度可以提高苜蓿的产量及返青率，从而提高rHSA的利用率。此外，王伟等[36]的研究表明种植年限对紫花苜蓿的生产力和品质均有影响。随着种植年限的增加，株高呈现先升高后降低的趋势，为了最大限度地提高rHSA的产量，应该把握好转基因植株的种植利用年限。
相比临床剂量为纳克或微克数量级的细胞因子、激素等蛋白质药物来讲，生产HSA的纯度要求更高，纯化物中即使含有0.001% 的杂质，也会给患者造成很大危害，所以基因重组人血清白蛋白的分离纯化是后续研究的关键。宿主自身的蛋白质和rHSA的分离是难题之一。目前，紫花苜蓿蛋白的提取方法有酸碱凝聚法、酸碱加热法、盐析法、有机溶剂法和超滤法等。不同的提取方法，以及对样品的处理方式、处理程度的不同，都会影响提取的质量[37]。从转基因紫花苜蓿中分离纯化出rHSA应该结合rHSA与苜蓿本身所含蛋白质的区别，探索最佳的工艺条件，包括提取温度、pH值等，在保证有效的蛋白质得率前提下降低生产成本。虽然目前酵母表达体系和植物生物反应器在rHSA的生产中取得了突破，实现了规模化生产，但是基于全球HSA的来源短缺及价格问题，对于获得较高表达量且能稳定表达rHSA的高效生物反应器还需进一步深入研究。
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doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.017
人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人血漿中主要的蛋白质，约占血浆总蛋白的60%。HSA的主要生理功能是维持血液胶体渗透压、结合并运输内源性及外源性物质[1]，临床上用于烧伤或严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒、肾病综合征、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂等，也可作为血浆增溶剂[2]。血浆白蛋白每下降2.5 g/L，死亡危险性增加24%～56%[3]；血浆白蛋白水平<20 g/L，患者死亡率几乎是100%[4]。在制药领域，HSA广泛用作保护剂、稳定剂和赋形剂等。目前，HSA全球年销售量超过600 t，与实际850 t的需求相比，约有250 t的年缺口[5]。临床使用的HSA主要通过人体血液提取，受人血来源不足和血源传染病的影响，供应相对紧张[6]。因此，重组人血清白蛋白的生产作为一种获得大量无病原的HSA的替代方法越来越受到重视。
在过去的几十年里，对于rHSA的表达研究已经涉及细菌、酵母、转基因动物和转基因植物等多种表达系统[7]。1981年，Lawn等[8]首次实现了HSA基因在大肠杆菌中的表达，表达量可达2.5 g/L。目前应用最多的是酵母表达体系，日本三菱公司采用AOX2启动子，通过补料分批培养，使rHSA在毕赤酵母中的表达量提高到10 g/L[9]。在临床医学应用中，HSA的用量较大，成年人每日最低剂量可达5～10 g，现有微生物表达系统的生产规模无法满足需要。与其他表达系统相比，动物生物反应器生产的rHSA 可进行转录后修饰，具有表达量高、生物活性好、不污染环境等优点。在转基因动物表达体系中，已有研究表明rHSA在转基因小鼠[10]、转基因牛的乳腺细胞[11]以及转基因蚕丝内[12]均成功表达。与其他的生物反应器相比，植物生物反应器所表达的外源蛋白质可完整地完成转录后修饰、折叠等过程，能表达出具有生物活性的功能蛋白。此外，植物生物反应器易于大规模生产外源蛋白，植物的田间种植和管理比其他系统更加低廉、有效，生产成本和管理投资等相比其他表达体系有很大的优势，并且不存在血源性病原体污染等风险。利用植物转基因表达rHSA的研究在转基因烟草[13]、马铃薯块茎[14]、水稻细胞悬浮培养[15]等受体中获得了成功。杨代常等[16]利用水稻胚乳表达的rHSA占糙米中可溶性蛋白总量的10.58%，表达量为2.75 g/kg，但是水稻本身的生产周期限制了 rHSA的生产。由于微生物发酵规模和植物生长周期等的限制，以及转基因动物制备rHSA存在传播疾病的潜在风险，到目前为止，进入工业化生产的rHSA主要来源于酵母和转基因水稻等，其制备的rHSA主要用作培养基或者制剂辅料，仍然不能满足临床用药需求。 紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种广泛种植的豆科多年生牧草，本身不具毒性[17]。它具有高营养、适应力强、适口性好等特点[18]，其蛋白含量一般在18%以上。此外，它的再生能力强，一年可以收割多次，能连续多年高产，是表达外源蛋白的理想受体材料[19]。近年来以紫花苜蓿作为生物反应器表达外源蛋白已取得一定进展[20-24]。本研究构建rHSA植物表达载体，采用农杆菌介导法将其基因转入紫花苜蓿中，并在转基因紫花苜蓿中成功表达，为利用转基因紫花苜蓿生产rHSA奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
紫花苜蓿选育品种“游客”（Medicago sativa L. cv. ‘Eureka’），购于百绿（天津）国际草业有限公司。
农杆菌株GV3101、质粒pCAMBIA1300均为本实验室保存。质粒pGEM-ALB购自上海权阳生物科技有限公司。Dzup基因组DNA抽提试剂盒购于上海生工（产品编号B518203）。限制性内切酶KpnⅠ/SalⅠ购于NEB公司。T4连接酶、DNA聚合酶购于Takara公司。植物生长激素购于北京索莱宝科技有限公司。VE386半干转移电泳槽购自Tanon公司。Rabbit Anti-Serum albumin购自Bioss公司，货号bs-0945R。Goat Anti-Rabbit IgG H&L （Alexa Fluor? 647）购自abcam公司，货号：ab150079。
1.2 方法
1.2.1 基因重组人血清白蛋白全长cDNA的克隆 根据已公布的人血清白蛋白基因CDS序列（NCBI Reference Sequence：NM_000477.5）设计HSA基因全长cDNA引物，在引物两端加上KpnⅠ/SalⅠ酶切位点，在5’端起始密码子前引入Kazak序列（5’-GCCACC-3’），引物为ALB-F（5’-CGGGGTACCGCCACCATGGATGCACACAAG-3’），ALB-R（5’-CGCGTCGACTTATTATTATAAGCCTAAGGC-3’）。
以人血清白蛋白中间质粒pGEM-ALB为模板，用特异性引物ALB-F、ALB-R进行PCR扩增，PCR反应条件为：98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳并回收，得到HSA全长序列。
1.2.2 表达载体的构建 将HSA扩增回收产物和pCAMBIA1300质粒分别用限制性内切酶KpnⅠ和SalⅠ酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后回收酶切产物。用T4连接酶将酶切产物于4 ℃连接过夜，将连接产物转入大肠杆菌DH5α得到的重组质粒，用限制性内切酶KpnⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定并测序，最终得到HSA基因序列插入质粒pCAMBIA1300的KpnⅠ和SalⅠ位点之间的重组质粒，即重组人血清白蛋白植物表达载体pCAMBIA1300-HSA。HSA基因由CAMV35s启动子控制，至Tnos转录终止（图1）。
1.2.3 农杆菌介导的紫花苜蓿转化及转基因植株的获得 采用电击法（Bio-Rad MicroPulser电穿孔仪，型号：1652100）将构建好的重组质粒pCAMBIA1300-HSA转入农杆菌GV3101感受态细胞中，28 ℃培養，经单菌落PCR鉴定获得阳性转基因工程菌。将阳性单克隆单菌落扩大培养用于紫花苜蓿的转化。紫花苜蓿的转化参考Liu等 [25]的方法进行。农杆菌转化菌液与紫花苜蓿愈伤组织共培养后，用25 mg/L的潮霉素进行抗性筛选，筛选得到的抗性愈伤组织经诱导分化、生根获得转基因组培苗。经炼苗后，将转基因组培苗移至土壤中自然条件培养。
1.2.4 转基因植株的鉴定 取转基因植株的叶片用液氮研磨成粉末，用Dzup基因组DNA抽提试剂盒进行抽提，提取液经氯仿抽提、无水乙醇沉淀、75%乙醇漂洗后晾干。用无菌双蒸水溶解沉淀得到转基因紫花苜蓿基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，用引物ALB-F、ALB-R进行PCR扩增，PCR结果呈阳性的即为阳性转基因紫花苜蓿植株。对基因检测为阳性的植株进行蛋白质提取，将叶片组织用液氮冷冻，每克组织中加入3 mL蛋白提取缓冲液[0.1 mol/L Tris-HCl，10 mmol/L MgCl2，18%（w/V）蔗糖，40 mmol/L β-巯基乙醇，pH 8.0]，研钵中充分研磨后用纱布过滤，离心得到的上清即为蛋白质粗提液。样品经10% SDS-PAGE凝胶电泳后用半干转移电泳槽进行转膜，25 V，4 mA/cm2转印1 h至硝酸纤维素膜上，将膜于室温封闭2 h后放在含HSA一抗（Rabbit anti-serum albumin）的稀释液中4 ℃孵育过夜；用TBST缓冲液洗膜3次（每次10 min）后，避光室温孵育二抗[Goat anti-rabbit IgG H&L （Alexa Fluor? 647）] 2 h，再用TBST缓冲液洗膜3次后用Typhoon FLA 9500扫膜。Western blotting检测结果呈阳性的即为成功表达rHSA的转基因紫花苜蓿植株。
2 结果与分析
2.1 HSA基因 cDNA的克隆与表达载体的构建
以人血清白蛋白中间质粒pGEM-ALB为模板，用特异性引物ALB-F、ALB-R进行PCR扩增，获得约1 760 bp的片段（图2）。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳并回收，得到HSA全长序列。HSA PCR扩增产物和pCAMBIA1300质粒分别用KpnⅠ和SalⅠ酶切，酶切产物用T4连接酶连接后转入大肠杆菌DH5α得转化子，提取重组质粒，用KpnⅠ和SalⅠ双酶切检测，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，得到1 760 bp左右的小片段和10 000 bp左右的大片段，分别与HSA基因片段和pCAMBIA1300质粒所作对照的条带保持一致（图3）。将重组质粒送上海生工进行测序，结果表明该质粒为HSA基因序列插入pCAMBIA1300质粒的KpnⅠ和SalⅠ位点间得到的重组质粒，即rHSA植物表达载体pCAMBIA1300-HSA。 2.2 农杆菌介导的紫花苜蓿转化
采用电击法将构建好的重组质粒pCAMBIA1300-HSA转入农杆菌GV3101感受态中，28 ℃培养，经单菌落PCR鉴定获得阳性转基因工程菌，菌落PCR结果见图4。
紫花苜蓿“游客”种子经2%（有效氯含量）次氯酸钠溶液表面消毒5 min，接种至1/2 MS培养基萌发生长5 d。分离无菌子叶至愈伤组织培养基上诱导愈伤组织的形成，继代培养20～30 d后可得到淡黄色的胚性脆性愈伤组织，选取生长状态良好的愈伤组织分离成直径0.5 cm的细胞团用于转化。用农杆菌重悬液（OD600=0.6）浸染愈伤组织2 min后共培养2～3 d，将转染后的紫花苜蓿愈伤组织转移至含有潮霉素25 mg/L和头孢噻肟钠500 mg/L的筛选培养基中筛选培养，20 d左右大部分愈伤组织褐化死亡。将具有Hyg抗性的愈伤组织继代培养，选择生长状态良好的愈伤组织进行诱导分化培养，培养4～5周后愈伤组织分化形成翠绿色的胚芽，继续培养至形成幼苗。诱导幼苗形成不定根，培养至形成发达根系，将无菌组培苗炼苗后移栽至室外自然条件下生长，其转化过程见图5。
2.3 转基因植株的鉴定
转化筛选获得26株再生植株，以Dzup基因组DNA抽提试剂对转基因植株的叶片进行基因组DNA抽提，以提取的基因组DNA为模板，用引物ALB-F、ALB-R进行PCR扩增，部分植株对应的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示。其中阳性对照为质粒pCAMBIA1300-HSA，阴性对照为野生型紫花苜蓿“游客”基因组DNA。泳道1～8获得了与阳性对照大小一致的约为1 760 bp的条带，确定为阳性转基因植株。
对部分基因检测为阳性的植株进行蛋白质提取，将样品于10% SDS-PAGE电泳后进行Western blotting检测，结果见图7。阳性对照为血源性人血清白蛋白，阴性对照为野生型紫花苜蓿“游客”蛋白粗提物。样品1～7均呈阳性，即成功表达rHSA的转基因紫花苜蓿植株。
3 讨论
1986年，Deak等[26]首次实现了苜蓿转基因体系的建立，证明了通过转基因技术改良紫花苜蓿的可行性。随后，针对紫花苜蓿转基因的研究越来越多，除生物反应器以外，还涉及抗非生物胁迫[27-28]、抗生物胁迫[29-30]和品质改良[31-32]等方面。紫花苜蓿蛋白含量高，含多种矿物元素、维生素等，在农牧业中发挥着重要的作用。紫花苜蓿作为优质牧草，其生物安全性有保障。本研究通过农杆菌介导法将HSA基因导入紫花苜蓿细胞中，经诱导获得转基因植株。基因组DNA的PCR检测和Western blotting检测结果表明rHSA在转基因紫花苜蓿中成功表达。到目前为止，多种rHSA表达体系的表达量都相对较低，由于生物的个体差异，转基因植株对于外源蛋白的表达量会有所不同，笔者会着眼于筛选出具有高表达量的转基因受体植株，以期为后续的研究打好基础。
对于高效利用转基因紫花苜蓿规模化生产rHSA，除了分子水平的优化和改进，还应该注重转基因紫花苜蓿的种植和管理，以便提高产量。紫花苜蓿分枝数和植株高度是影响其产量和品质的主要因素。王彦华等[33]研究发现适当减少播种量可以提高植株高度。王茜等[34] 的研究表明土壤水分和施氮水平具有显著的互作效应。在缺水的地區或季节，施肥与灌溉应同步进行；在含水量较高的地区，适当增施氮肥有利于紫花苜蓿高产。紫花苜蓿一年可刈割多次，刈割时留茬高度对苜蓿的再生和产量有显著影响。王坤龙等[35]通过测定不同留茬高度对苜蓿根系生长、储藏性营养物质含量和返青率的影响，发现随着留茬高度的增加，主根直径、根干重和侧根总数均增加。所以，适当地增加留茬高度可以提高苜蓿的产量及返青率，从而提高rHSA的利用率。此外，王伟等[36]的研究表明种植年限对紫花苜蓿的生产力和品质均有影响。随着种植年限的增加，株高呈现先升高后降低的趋势，为了最大限度地提高rHSA的产量，应该把握好转基因植株的种植利用年限。
相比临床剂量为纳克或微克数量级的细胞因子、激素等蛋白质药物来讲，生产HSA的纯度要求更高，纯化物中即使含有0.001% 的杂质，也会给患者造成很大危害，所以基因重组人血清白蛋白的分离纯化是后续研究的关键。宿主自身的蛋白质和rHSA的分离是难题之一。目前，紫花苜蓿蛋白的提取方法有酸碱凝聚法、酸碱加热法、盐析法、有机溶剂法和超滤法等。不同的提取方法，以及对样品的处理方式、处理程度的不同，都会影响提取的质量[37]。从转基因紫花苜蓿中分离纯化出rHSA应该结合rHSA与苜蓿本身所含蛋白质的区别，探索最佳的工艺条件，包括提取温度、pH值等，在保证有效的蛋白质得率前提下降低生产成本。虽然目前酵母表达体系和植物生物反应器在rHSA的生产中取得了突破，实现了规模化生产，但是基于全球HSA的来源短缺及价格问题，对于获得较高表达量且能稳定表达rHSA的高效生物反应器还需进一步深入研究。
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