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测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对免IgG（氯霉素抗体）的抗体。加入氯霉素抗体，氯霉素酶标记物，氯霉素标准或样品溶液。游离氯霉素与氯霉素酶标记物竞争氯霉素抗体结合位点（竞争性酶免疫分析），同时氯霉素抗体也与固定的抗体结合。没有结合的氯霉素酶标记物在洗涤步骤中被除去，氯霉素酶标记物与氯霉素抗体结合的数量反比于游离氯霉素的数量，以TMB为底物，测量450nm波长的吸光度值，按标准曲线计算样品中的氯霉素含量。本方法的测定低限为100ng／kg，添加回收率及精密度试验表明符合目前国际上氯霉素残留检测的要求