论文部分内容阅读
摘要 鸭瘟病毒是引起鸭、鹅等禽类急性、败血性传染病的主要病原，可造成鸭群规模性死亡，严重影响养鸭业的发展。本文通过分析江西上饶某鸭场的一例鸭瘟病例，总结鸭瘟病毒的分离、鉴定方法，以期为广大养鸭大户提供参考。
关键词 鸭瘟病毒；分离；鉴定
中图分类号 S858.32 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0261-02
鸭瘟，俗称“大头瘟”，是一种高致病性传染病，多发生于成年种鸭和蛋鸭，我国于1957年首次报道此病。鸭瘟在临床上主要表现为高稽留热、精神不振、痢疾、流泪、头颈肿大等，其病原为鸭瘟病毒，是一种疱疹病毒[1]。随着规模化养殖业的发展，鸭瘟的发病率逐渐升高，在同一地区或同一养鸭场间传播迅速，且死亡率非常高，没有免疫接种过的鸭群死亡率高达100%，给养鸭业带来了巨大的经济损失。本文就广丰区某鸭场的一起鸭瘟病例，通过对其病原进行分离鉴定，总结鸭瘟病毒的分离鉴定方法，为鸭瘟病毒的进一步研究奠定基础。
1 鸭瘟病鸭临床资料
病鸭病初精神沉郁，食欲不振，接着拉黄绿色粪便，肛门周围的羽毛结块；眼结膜充血、眼睑水肿、头部肿大；双翅下垂，不愿走动；3 d后死亡。
2 鸭瘟病毒分离
鸭瘟病毒主要通过侵害鸭的免疫器官而引发鸭瘟，因此通常从病鸭的血液或肝脏、脾脏、肾脏等组织中分离出鸭瘟病毒。主要包括细胞培养、鸭胚分离、雏鸭分离3种方法[2]。
2.1 细胞培养
研究表明，鸭瘟病毒接种到鸭胚成纤维细胞中，可提高成纤维细胞的产毒能力，蚀斑明显，病毒分离效果好。将无菌病料接种到鸭胚成纤维细胞中培养2～4 d后，若出现细胞变圆、细胞聚集成葡萄状、蚀斑明显，则表明病毒分离效果好；若无上述病变，可将细胞多传几代，若始终无细胞病变，则可能是因为毒株毒力较小，不足以引起细胞病变。
2.2 鸭胚分离
无菌病料接种到9～14日龄的鸭胚绒毛尿囊膜中培养4～10 d，通过观察鸭胚死亡状况以及鸭胚病理变化来判断病毒分离效果。病毒分离效果好主要表现为鸭胚死亡，鸭胚内呈弥散性出血，胚体出血，部分绒毛尿囊膜上有灰白色坏死灶。若首次分离效果不好，可均质化鸭胚绒毛尿囊膜，然后将其盲传2～4代。
2.3 雏鸭分离
无菌病料肌肉注射到1日龄的雏鸭上饲养3～12 d，观察雏鸭的死亡状况。若雏鸭死亡，剖检病鸭观察是否具有鸭瘟的典型病变，并结合免疫荧光技术或攻毒保护试验以确诊。若雏鸭无死亡，可能是因为毒株毒力较少不足以引起病变，可通过检测雏鸭的抗体水平来确诊。
3 鸭瘟病毒鉴定
3.1 血清学方法
血清学方法主要包括血清中和试验（SN）、微量固相放射免疫试验（Micro-SPRIA）、琼脂糖凝胶沉淀试验（AGP）、反向間接血凝试验（RPHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术6种方法[3]。以上方法均能检测到鸭瘟病毒，每种方法又有各自的特点，需根据实际情况选择合适的检测方法。
3.1.1 血清中和试验（SN）。这种方法是采用固定的血清稀释病毒或固定病毒稀释血清的方法接种动物，计算中和指数（M），根据M判断是否受到病毒感染。若0 3.1.2 微量固相放射免疫试验 （Micro-SPRIA）。这种方法是将抗体或抗原用同位素标记，然后用能够吸附抗体的材料作为载体，测定抗体或抗原含量。此方法可以直接检测病鸭的肝脏、脾脏、血清等病料，是一种特异性强、敏感性高，且快速便宜的方法，但是对试验条件要求较高。
3.1.3 琼脂糖凝胶沉淀试验（AGP）。这种方法是在琼脂糖凝胶中进行的一种抗原抗体反应，特异性强、操作简单，对实验条件要求不高，但是敏感性不强。
3.1.4 反向间接血凝试验（RPHA）。这种方法是利用抗体致敏红细胞在相应抗原存在时会凝集而进行检侧。这种方法操作简便，检测快速，但是敏感性较低，当样品量较少时检测不出来。
3.1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）。这种方法对试验条件、样品量的要求较低，且操作简便、检测快速，结果容易判断，是一种非常实用的检测方法，在基层推广起来较容易[4]。
3.1.6 免疫荧光技术。这种方法的本质是抗原抗体反应，具有高度特异性、敏感性高、检测快速等优点，但是对设备的要求高，价格昂贵，程序操作复杂，因此这种方法的实用性不强。
3.2 分子生物学诊断
3.2.1 聚合酶链式反应（PCR）。PCR是目前应用最为广泛的技术，对样品质量要求少，检测结果准确，具有特异性强、敏感度高、操作简便、检测快速等优点。较其他诊断方法更能节约时间，更能为防治提供宝贵的时间。
3.2.2 核酸探针技术。此技术主要是将核酸用放射性或非放射性物质标记，作为探针以识别待检样品中的特定核酸序列。这种方法的准确性高，结果较容易判定，对仪器设备的要求不高，是最早应用鸭瘟病毒检测的分子生物学方法，也是目前应用广泛的检测方法。
3.2.3 原位杂交技术（ISH）。此技术不仅能够检测到鸭瘟病毒，还能将鸭瘟病毒定位，有利于观察细胞形态以及病理变化，是一种将分子生物学和组织化学结合的技术，具有特异性强、直观的特点。此技术可用于鸭瘟病毒侵染机体以及其致病机理的研究。
4 参考文献
[1] 徐娇，宋旭，殷中琼，等.18味中药提取物体外抗鸭瘟病毒活性的研究[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2013（1）：105-110.
[2] 张坤.鸭瘟病毒SDWF株的分离鉴定及致病性研究[D].泰安：山东农业大学，2012.
[3] 刘昆.浅谈鸭瘟病毒的分离与鉴定方法[J].山东畜牧兽医，2014（7）：36-37.
[4] 郭霄峰，廖明，严英华，等.利用PCR检测鸭瘟病毒[J].中国兽医科技，2002（4）：13-16.
关键词 鸭瘟病毒；分离；鉴定
中图分类号 S858.32 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0261-02
鸭瘟，俗称“大头瘟”，是一种高致病性传染病，多发生于成年种鸭和蛋鸭，我国于1957年首次报道此病。鸭瘟在临床上主要表现为高稽留热、精神不振、痢疾、流泪、头颈肿大等，其病原为鸭瘟病毒，是一种疱疹病毒[1]。随着规模化养殖业的发展，鸭瘟的发病率逐渐升高，在同一地区或同一养鸭场间传播迅速，且死亡率非常高，没有免疫接种过的鸭群死亡率高达100%，给养鸭业带来了巨大的经济损失。本文就广丰区某鸭场的一起鸭瘟病例，通过对其病原进行分离鉴定，总结鸭瘟病毒的分离鉴定方法，为鸭瘟病毒的进一步研究奠定基础。
1 鸭瘟病鸭临床资料
病鸭病初精神沉郁，食欲不振，接着拉黄绿色粪便，肛门周围的羽毛结块；眼结膜充血、眼睑水肿、头部肿大；双翅下垂，不愿走动；3 d后死亡。
2 鸭瘟病毒分离
鸭瘟病毒主要通过侵害鸭的免疫器官而引发鸭瘟，因此通常从病鸭的血液或肝脏、脾脏、肾脏等组织中分离出鸭瘟病毒。主要包括细胞培养、鸭胚分离、雏鸭分离3种方法[2]。
2.1 细胞培养
研究表明，鸭瘟病毒接种到鸭胚成纤维细胞中，可提高成纤维细胞的产毒能力，蚀斑明显，病毒分离效果好。将无菌病料接种到鸭胚成纤维细胞中培养2～4 d后，若出现细胞变圆、细胞聚集成葡萄状、蚀斑明显，则表明病毒分离效果好；若无上述病变，可将细胞多传几代，若始终无细胞病变，则可能是因为毒株毒力较小，不足以引起细胞病变。
2.2 鸭胚分离
无菌病料接种到9～14日龄的鸭胚绒毛尿囊膜中培养4～10 d，通过观察鸭胚死亡状况以及鸭胚病理变化来判断病毒分离效果。病毒分离效果好主要表现为鸭胚死亡，鸭胚内呈弥散性出血，胚体出血，部分绒毛尿囊膜上有灰白色坏死灶。若首次分离效果不好，可均质化鸭胚绒毛尿囊膜，然后将其盲传2～4代。
2.3 雏鸭分离
无菌病料肌肉注射到1日龄的雏鸭上饲养3～12 d，观察雏鸭的死亡状况。若雏鸭死亡，剖检病鸭观察是否具有鸭瘟的典型病变，并结合免疫荧光技术或攻毒保护试验以确诊。若雏鸭无死亡，可能是因为毒株毒力较少不足以引起病变，可通过检测雏鸭的抗体水平来确诊。
3 鸭瘟病毒鉴定
3.1 血清学方法
血清学方法主要包括血清中和试验（SN）、微量固相放射免疫试验（Micro-SPRIA）、琼脂糖凝胶沉淀试验（AGP）、反向間接血凝试验（RPHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术6种方法[3]。以上方法均能检测到鸭瘟病毒，每种方法又有各自的特点，需根据实际情况选择合适的检测方法。
3.1.1 血清中和试验（SN）。这种方法是采用固定的血清稀释病毒或固定病毒稀释血清的方法接种动物，计算中和指数（M），根据M判断是否受到病毒感染。若0
3.1.3 琼脂糖凝胶沉淀试验（AGP）。这种方法是在琼脂糖凝胶中进行的一种抗原抗体反应，特异性强、操作简单，对实验条件要求不高，但是敏感性不强。
3.1.4 反向间接血凝试验（RPHA）。这种方法是利用抗体致敏红细胞在相应抗原存在时会凝集而进行检侧。这种方法操作简便，检测快速，但是敏感性较低，当样品量较少时检测不出来。
3.1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）。这种方法对试验条件、样品量的要求较低，且操作简便、检测快速，结果容易判断，是一种非常实用的检测方法，在基层推广起来较容易[4]。
3.1.6 免疫荧光技术。这种方法的本质是抗原抗体反应，具有高度特异性、敏感性高、检测快速等优点，但是对设备的要求高，价格昂贵，程序操作复杂，因此这种方法的实用性不强。
3.2 分子生物学诊断
3.2.1 聚合酶链式反应（PCR）。PCR是目前应用最为广泛的技术，对样品质量要求少，检测结果准确，具有特异性强、敏感度高、操作简便、检测快速等优点。较其他诊断方法更能节约时间，更能为防治提供宝贵的时间。
3.2.2 核酸探针技术。此技术主要是将核酸用放射性或非放射性物质标记，作为探针以识别待检样品中的特定核酸序列。这种方法的准确性高，结果较容易判定，对仪器设备的要求不高，是最早应用鸭瘟病毒检测的分子生物学方法，也是目前应用广泛的检测方法。
3.2.3 原位杂交技术（ISH）。此技术不仅能够检测到鸭瘟病毒，还能将鸭瘟病毒定位，有利于观察细胞形态以及病理变化，是一种将分子生物学和组织化学结合的技术，具有特异性强、直观的特点。此技术可用于鸭瘟病毒侵染机体以及其致病机理的研究。
4 参考文献
[1] 徐娇，宋旭，殷中琼，等.18味中药提取物体外抗鸭瘟病毒活性的研究[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2013（1）：105-110.
[2] 张坤.鸭瘟病毒SDWF株的分离鉴定及致病性研究[D].泰安：山东农业大学，2012.
[3] 刘昆.浅谈鸭瘟病毒的分离与鉴定方法[J].山东畜牧兽医，2014（7）：36-37.
[4] 郭霄峰，廖明，严英华，等.利用PCR检测鸭瘟病毒[J].中国兽医科技，2002（4）：13-16.