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建立了一种利用高效液相色谱法同时测定近视乐滴眼液中异紫堇定和普洛托品两种生物碱的方法。该法以Shim-pack C18为色谱柱，甲醇磷酸盐缓冲溶液（65：35，pH7．4）为流动相，检测液长为285nm进行样品测定，异紫堇定和普洛托品的平均回收率分别为99．1％和98．7％，相对标准偏差RSD分别为1．4％和1．6％。该方法简便、准确、环保，可用于近视乐滴眼液的质量控制。