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摘要：目的 觀察针刺“三阴交”“百会”对注意缺陷多动障碍（ADHD）模型大鼠行为学及前额叶皮质中多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）含量的影响，探讨针刺防治ADHD的作用机制。方法 4周龄SHR大鼠随机分为模型组、西药组、针刺组，同周龄WKY大鼠设为正常组，每组10只，针刺组针刺大鼠“三阴交”“百会”，留针15 min；西药组大鼠每日予利他林2 mg/kg灌胃，在大鼠夜周期连续干预4周。采用开场实验、高架十字迷宫、新物体识别实验评估大鼠自发性行为、冲动行为及学习记忆能力，高效液相色谱法检测前额叶皮质中DA、NE、5-HT水平。结果 与正常组比较，模型组大鼠各项行为学参数均明显升高（P<0.05），前额叶皮质中DA、NE及5-HT水平明显降低（P<0.05）；与模型组比较，针刺组大鼠开场实验总运动距离、理毛次数及直立次数，高架十字迷宫开放臂进入次数百分比和开放臂停留时间百分比均明显减少（P<0.05），新物体识别实验对新物体偏好指数明显增高（P<0.05），前额叶皮质中NE、5-HT水平明显升高（P<0.05）。结论 针刺“百会”“三阴交”可减少ADHD模型大鼠自发性活动及冲动行为，增强其学习记忆能力，其机制可能与提高前额叶皮质中NE、5-HT水平相关。
关键词：注意缺陷多动障碍；针刺；去甲肾上腺素；5-羟色胺；多巴胺；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.010
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）09-0039-05
Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture at “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） on behaviors and contents of monoamine neurotransmitter dopamine （DA）， noradrenalin （NE） and 5-hydroxytrypamine （5-HT） in prefrontal cortex （PFC） of attention deficit hyperactivity disorder （ADHD） rats； To discuss mechanism of action of acupuncture for prevention and treatment of ADHD. Methods 4-week-old SHR rats were randomly divided into the model group， Western medicine group and acupuncture group， and WKY rats with the same age were selected as the normal control group， with 10 rats in each group. Acupuncture was applied to “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） of rats in acupuncture group for 15 min. The rats in Western medicine group was given MPH （ritalin） for gavage， and rats were treated for 4 weeks in the dark-phase. Open field test （OFT）， elevated plus maze （EPM） and novel object recognition test （NORT） were conducted to evaluate the spontaneous activity， impulsivity and learning-memorial ability of rats individually at the end of treatment. Contents of DA， NE and 5-HT in PFC were detected by HPLC. Results Compared with the normal control group， all of the behavior parameters of rats in model group were significantly higher （P<0.05）， and the contents of DA， NE and 5-HT in PFC of model group were lower than those of normal control group （P<0.05）. Compared with the model group， acupuncture group showed shorter movement distance， less rearing and fewer grooming activities in the OFT； percentages of times of entering the open arms and staying duration were reduced in the total period in the EPM； preference index in the NORT was elevated （P<0.05）； the contents of NE and 5-HT in PFC of acupuncture group increased significantly （P<0.05）. Conclusion Acupuncture at “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） canreduce the spontaneous activity and impulsivity， and improve learning and memory ability of ADHD model rats， which may be related to elevated contents of NE and 5-HT in the PFC. Keywords： attention deficit hyperactivity disorder； acupuncture； noradrenalin； 5-hydroxytrypamine； dopamine； rats
注意缺陷多动障碍（attentional deficit hyperactivity disorder，ADHD）为儿童期最常见的行为障碍性疾病，目前，常规西药治疗不良反应较大。研究发现，由前额叶皮质、尾状核及小脑组成调控注意、情绪及行为的神经网络参与了ADHD病机发展[1]，与此神经网络相关神经元功能紊乱导致的单胺类神经递质如多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）及5-羟色胺（5-HT）活动改变进一步导致ADHD的病理改变[2]。大量临床研究表明，针刺单用或配合常规药物及行为疗法治疗ADHD优于单纯常规药物和行为疗法[3-4]，但其作用机制迄今尚未见报道。因此，本实验观察针刺对ADHD模型大鼠行为学（自发性活动、冲动、学习记忆）的影响，初步探讨其是否通过调控前额叶皮质中DA、NE及5-HT水平发挥其疗效，为临床上用于治疗ADHD提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
SPF级SHR大鼠40只，WKY大鼠10只，均为雄性，3周龄，体质量（40±10）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于明暗交替12 h/12 h、温度20～22 ℃、相对湿度（50±10）%的SPF级动物房，自由摄食饮水。动物适应性喂养5 d后编号，先采用开场实验观察大鼠自发性行为[5]，按动物5 min内总运动距离分层随机区组设计[6]，Excel2010产生随机数字，将动物按5 min内总运动距离升序排序，按顺序每3只动物分为1个区组，共分成10个区组，每一区组中3只大鼠再按随机数升序依次分入3个随机组中，3个随机组中每组分到10只动物，进而将SHR大鼠分为模型组、西药组、针刺组，每组10只。WKY大鼠作为正常组。
1.2 主要试剂与仪器
标准品DA（批号H8502）、NE（批号A7257）和5-HT（批号H9523），色谱甲醇、色谱乙腈，美国Sigma公司；乙二胺四乙酸、磷酸二氢钾，北京索莱宝科技有限公司。开场试验箱（63007型）、高架十字迷宫（63009型）、Barnes迷宫（63027型）、SMART 3.0小动物行为学视频采集与分析系统，美国Panlab公司；Agilent1100高效液相色谱系统，美国Agilent公司；CoulochemⅢ电化学检测器，美国ESA公司；Q700智能型超声波破碎仪，美国Qsonica公司；华佗牌无菌一次性针具，苏州医疗用品厂有限公司，规格0.16 mm×7 mm。
1.3 干预
适应性喂养1周后开始干预。针刺组：用特制棉布袋将大鼠立位固定于木架上，暴露四肢，取“百会”“三阴交”，定位及针刺操作参照《实验针灸学》[7]。“百会”向尾部斜刺，“三阴交”向后爪部斜刺5 mm，每穴行均匀捻转刺激30 s；施针时用手轻轻安抚大鼠固定其头部，减少额外刺激；留针15 min，间隔5 min行针1次，频率120～150 次/min，每日1次。正常组和模型组均以相同方法束缚但不进行针刺。西药组：利他林（MPH速释剂型，购于Novartis，批号NDC 0078-0440-05）每日灌胃2 mg/kg，用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成混悬液，超声溶解，1日量分2次灌胃（大鼠夜周期9：30-10：30、15：30-16：30时）。连续干预4周。20 W可夹式红色电灯用以在抓取动物、行针及灌胃时照明[8]。
1.4 行为学检测
当日首次给药30 min后在大鼠夜周期进行行为学测试。动物分组对动物行为学操作人员设盲，过程中保持周边光线和噪声的一致性；每只大鼠测试完后用75%乙醇及时擦拭迷宫，清除粪便及气味，以免干扰下只大鼠测试。
1.4.1 开场实验
采用内壁100 cm×100 cm×50 cm的木质敞箱，通过软件将箱底设置成25个方格（20 cm×20 cm）。测试开始时将大鼠放在開场箱底部中央，通过视频分析系统自动记录其5 min内总运动距离（cm）、直立次数（大鼠前爪腾空或攀附开场箱侧壁计为1次）、理毛次数及排粪次数。
1.4.2 高架十字迷宫
高架十字迷宫由2个开放臂（30 cm×5 cm）和2个闭合臂（30 cm×5 cm×40 cm）组成，整个设备高于地面50 cm。测试时将大鼠头朝开放臂方向放在四臂交叉的中央区，高架十字迷宫顶部强光源始终打开。记录5 min内活动指标：开放臂进入次数（必须2只前爪进入臂内）、开放臂停留时间、闭合臂进入次数、闭合臂停留时间、高架十字迷宫总进入次数、开放臂进入次数比（开放臂进入次数与迷宫总进入次数比值）、开放臂停留时间比（开放臂进入时间与迷宫总进入时间比值）。
1.4.3 新物体识别实验
新物体识别实验是基于哺乳类动物易趋向于新颖事物的天性而评估学习记忆功能[9]。测试流程分训练期及测试期：在训练期，测试箱内放入形状、颜色及大小相同的2个物体，对称固定于底部对角线上（外1/3处），然后将大鼠背朝两物体（大鼠鼻尖距离两物体的长度一致）放入测试箱3 min，当大鼠嘴部或鼻部朝向物体且在距离物体1 cm范围内时，即被认为探索物体，记录大鼠在此阶段对2个相同物体的探索时间；1 d后进入测试期，将其中一物体换成颜色和形状均不相同但大小相同的新颖物体（保持新物体在测试盒内位置不变），记录5 min内大鼠对新颖物体与熟悉物体的探索时间。采用偏好指数（preference index，PI），即大鼠在训练期探索其中一个物体或测试期探索新物体的时间与探索两物体总时间的比值作为评价大鼠记忆能力的指标。 1.5 单胺类神经递质含量测定
末次给药后1 h，CO2麻醉断头处死大鼠，根据大鼠脑立体定位图，冰台上快速剖取大脑，分离出前额叶皮质，冰生理盐水清洗，滤纸吸干表面水分。称取100 mg左右前额叶皮质，放入1 mL冰冷0.1 mol/L高氯酸溶液（含0.5 mmol /L EDTA、0.01%半胱氨酸）中，冰浴中匀浆离心（4 ℃、3000×g，20 min，取上清液继续离心（室温、12 000×g，3 min），取上清液、以針头式过滤器（0.45 μm）过滤，取滤液以去离子双蒸水1∶4稀释后进行NE、5-HT和DA高效液相-电化学检测。检测条件：色谱柱采用Phenomenex Luna C18反相柱（50 mm×2.0 mm×3 μm），流动相含磷酸二氢钠49.9 mmol/L、EDTA 200 μmol/L、辛烷磺酸钠盐0.2 mmol/L、氯化钠9.9 mmol/L、甲醇100 mL、超纯水（pH 2.6）900 mL，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，工作电压0.7 V。所有数据重复3次。
1.6 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。对数据进行正态分布检验及组间方差齐性检验，符合正态分布且方差齐，组间比较用方差分析，数据不符合正态分布或方差不齐则用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 针刺对SHR大鼠自发性活动的影响
与正常组比较，模型组大鼠总运动距离、直立次数、理毛次数及排粪次数明显增加（P<0.05）；与模型组比较，针刺组和西药组大鼠总运动距离、直立次数及理毛次数明显减少（P<0.05），针刺组大鼠总运动距离少于西药组（P<0.05），两组直立次数比较差异无统计学意义（P>0.05）；各组SHR大鼠排粪次数比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。
2.2 针刺对SHR大鼠冲动行为的影响
各组SHR大鼠进入开放臂次数比及开放臂停留时间比较正常组均明显增加（P<0.05）；西药组及针刺组大鼠开放臂进入次数比及开放臂停留时间比较模型组均明显减少（P<0.05）；针刺组大鼠较西药组开放臂停留时间比明显减少（P<0.05）。结果见表2。
2.3 针刺对SHR大鼠学习记忆能力的影响
在训练期，各组大鼠对2个相同物体探索时间相似（P>0.05），对物体无明显偏好选择。在测试期，各组SHR大鼠PI均明显高于正常组（P<0.05），针刺组大鼠对新物体探索时间较模型组明显增加（P<0.05）。结果见表3。
2.4 针刺对SHR大鼠前额叶皮质中单胺类神经递质的影响
与正常组比较，模型组大鼠DA、NE、5-HT含量明显降低（P<0.05）；与模型组比较，针刺组和西药组大鼠NE、5-HT含量明显增加（P<0.05）。结果见表4。
3 讨论
ADHD属中医学“脏躁”“烦躁”等范畴。《素问·阴阳应象大论篇》谓“阴静阳躁”，即阴主柔静，阳主刚躁，两者充盛和谐，则机体调节功能（如动与静、兴奋与抑制、亢进与减退等）协调无病。小儿ADHD系由阴阳动静失衡而致，即阴静不足，阴不制阳而致神不灵、魂不安、意不固、志不坚。《灵枢·根结》云：“用针之要，在于知调阴与阳。”故针刺治疗ADHD应以头部腧穴及阴经腧穴为主，以期益精填髓、调和阴阳、安神定志。交会穴为多经经气汇聚之处，可起到调诸经的目的。“病变在脑，首取督脉”，而百会为督脉、足太阳、足少阳、手少阳及足厥阴之会，百会又可通过足太阳经的背俞穴与五脏六腑经气相通，取之能填精益髓、疏通脑络、醒神开窍；三阴交为足三阴之会，可通调肝、脾、肾脏腑精气。故合用百会、三阴交治疗ADHD，可达通督调神、益智复聪之功。因此，临床治疗儿童ADHD时多注重对这两穴的应用，以提高疗效。
本实验选择在逆转的暗周期（大鼠清醒周期）里，对动物进行MPH治疗及其他干预，以模仿临床MPH用药方案（ADHD患儿在昼夜节律的“活动期”接受MPH治疗）[10-11]。开场实验的总运动距离、直立次数、理毛次数分别反映动物的自发性活动、对新奇环境的探究程度及情绪紧张程度。本研究发现，针刺可明显减少SHR大鼠在逆转的暗周期运动距离、直立次数及理毛次数，而对同样反映情绪紧张程度的排粪次数没有影响。焦虑相关的冲动采用高架十字迷宫评估，进入开放臂次数及停留时间的增加可能反映了冲动[12-13]，本研究中SHR大鼠进入开放臂次数及停留时间均多于正常组WKY大鼠，表明SHR大鼠可表现出ADHD样的冲动行为；MPH及针刺均能减少SHR大鼠进入开放臂次数及停留时间，针刺更能减少SHR大鼠进入开放臂停留时间，表明针刺较MPH更能减轻SHR大鼠的冲动行为。
有研究发现，3周龄大鼠（品系不详）连续21 d（周末停用）口服MPH3（5 mg/kg，每日2次），大鼠未表现出对新颖物体明显偏好[14]，而Heyser C J等[15]也发现对断乳期（21日龄）和围青春期（34日龄）的SD大鼠连续7 d腹腔注射MPH（5 mg/kg，每日2次），可损伤其识别记忆功能，但因腹腔注射释放药物较迅速，其给药途径对神经系统的影响与药物口服可能不同[16]。而本研究中，西药组与针刺组大鼠对新颖物体PI显著高于模型组，表明长期口服MPH及针刺治疗均可增强SHR大鼠记忆能力，而MPH对SHR大鼠记忆学习能力改善结果与上述报道不同，可能与MPH给药途径、动物品系等不同有关。
ADHD病理机制尚未明确，研究发现脑组织内主要神经递质（如DA、5-HT）与冲动行为的调控有关[17-18]，背侧纹状体DA信号中多巴胺D1受体降低可减轻冲动，青春期长期给予MPH可增强SHR大鼠内侧前额叶皮质中DA转运体功能，而MPH治疗停止后仍可减少成年期细胞外DA的水平[19]。降低的中枢5-HT信号增加大鼠冲动行为及选择，中缝背核5-HT神经元的药理学及光遗传活化可降低选择冲动[20]。学习记忆部分依赖于前额叶皮质的功能整合，其很大程度上依赖于突触DA及NE的最优水平；研究发现，SHR大鼠前额叶皮质中NE释放减少[21]，而MPH被认为可保持DA及NE的水平。可恢复体内儿茶酚胺释放未达最优水平个体的认知功能[22]。本研究中，针刺组及西药组大鼠前额叶皮质中NE、5-HT较模型组明显升高（P<0.05），针刺组大鼠前额叶皮质中DA含量与模型组比较差异无统计学意义，表明针刺“百会”“三阴交”可能通过增加SHR大鼠前额叶皮质中NE、5-HT含量而减轻大鼠夜周期多动及冲动行为、增强大鼠学习记忆能力。 参考文献：
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（收稿日期：2018-03-25）
（修回日期：2018-04-08；編辑：华强）
关键词：注意缺陷多动障碍；针刺；去甲肾上腺素；5-羟色胺；多巴胺；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.010
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）09-0039-05
Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture at “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） on behaviors and contents of monoamine neurotransmitter dopamine （DA）， noradrenalin （NE） and 5-hydroxytrypamine （5-HT） in prefrontal cortex （PFC） of attention deficit hyperactivity disorder （ADHD） rats； To discuss mechanism of action of acupuncture for prevention and treatment of ADHD. Methods 4-week-old SHR rats were randomly divided into the model group， Western medicine group and acupuncture group， and WKY rats with the same age were selected as the normal control group， with 10 rats in each group. Acupuncture was applied to “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） of rats in acupuncture group for 15 min. The rats in Western medicine group was given MPH （ritalin） for gavage， and rats were treated for 4 weeks in the dark-phase. Open field test （OFT）， elevated plus maze （EPM） and novel object recognition test （NORT） were conducted to evaluate the spontaneous activity， impulsivity and learning-memorial ability of rats individually at the end of treatment. Contents of DA， NE and 5-HT in PFC were detected by HPLC. Results Compared with the normal control group， all of the behavior parameters of rats in model group were significantly higher （P<0.05）， and the contents of DA， NE and 5-HT in PFC of model group were lower than those of normal control group （P<0.05）. Compared with the model group， acupuncture group showed shorter movement distance， less rearing and fewer grooming activities in the OFT； percentages of times of entering the open arms and staying duration were reduced in the total period in the EPM； preference index in the NORT was elevated （P<0.05）； the contents of NE and 5-HT in PFC of acupuncture group increased significantly （P<0.05）. Conclusion Acupuncture at “Sanyinjiao” （SP6） and “Baihui” （GV20） canreduce the spontaneous activity and impulsivity， and improve learning and memory ability of ADHD model rats， which may be related to elevated contents of NE and 5-HT in the PFC. Keywords： attention deficit hyperactivity disorder； acupuncture； noradrenalin； 5-hydroxytrypamine； dopamine； rats
注意缺陷多动障碍（attentional deficit hyperactivity disorder，ADHD）为儿童期最常见的行为障碍性疾病，目前，常规西药治疗不良反应较大。研究发现，由前额叶皮质、尾状核及小脑组成调控注意、情绪及行为的神经网络参与了ADHD病机发展[1]，与此神经网络相关神经元功能紊乱导致的单胺类神经递质如多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）及5-羟色胺（5-HT）活动改变进一步导致ADHD的病理改变[2]。大量临床研究表明，针刺单用或配合常规药物及行为疗法治疗ADHD优于单纯常规药物和行为疗法[3-4]，但其作用机制迄今尚未见报道。因此，本实验观察针刺对ADHD模型大鼠行为学（自发性活动、冲动、学习记忆）的影响，初步探讨其是否通过调控前额叶皮质中DA、NE及5-HT水平发挥其疗效，为临床上用于治疗ADHD提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
SPF级SHR大鼠40只，WKY大鼠10只，均为雄性，3周龄，体质量（40±10）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于明暗交替12 h/12 h、温度20～22 ℃、相对湿度（50±10）%的SPF级动物房，自由摄食饮水。动物适应性喂养5 d后编号，先采用开场实验观察大鼠自发性行为[5]，按动物5 min内总运动距离分层随机区组设计[6]，Excel2010产生随机数字，将动物按5 min内总运动距离升序排序，按顺序每3只动物分为1个区组，共分成10个区组，每一区组中3只大鼠再按随机数升序依次分入3个随机组中，3个随机组中每组分到10只动物，进而将SHR大鼠分为模型组、西药组、针刺组，每组10只。WKY大鼠作为正常组。
1.2 主要试剂与仪器
标准品DA（批号H8502）、NE（批号A7257）和5-HT（批号H9523），色谱甲醇、色谱乙腈，美国Sigma公司；乙二胺四乙酸、磷酸二氢钾，北京索莱宝科技有限公司。开场试验箱（63007型）、高架十字迷宫（63009型）、Barnes迷宫（63027型）、SMART 3.0小动物行为学视频采集与分析系统，美国Panlab公司；Agilent1100高效液相色谱系统，美国Agilent公司；CoulochemⅢ电化学检测器，美国ESA公司；Q700智能型超声波破碎仪，美国Qsonica公司；华佗牌无菌一次性针具，苏州医疗用品厂有限公司，规格0.16 mm×7 mm。
1.3 干预
适应性喂养1周后开始干预。针刺组：用特制棉布袋将大鼠立位固定于木架上，暴露四肢，取“百会”“三阴交”，定位及针刺操作参照《实验针灸学》[7]。“百会”向尾部斜刺，“三阴交”向后爪部斜刺5 mm，每穴行均匀捻转刺激30 s；施针时用手轻轻安抚大鼠固定其头部，减少额外刺激；留针15 min，间隔5 min行针1次，频率120～150 次/min，每日1次。正常组和模型组均以相同方法束缚但不进行针刺。西药组：利他林（MPH速释剂型，购于Novartis，批号NDC 0078-0440-05）每日灌胃2 mg/kg，用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成混悬液，超声溶解，1日量分2次灌胃（大鼠夜周期9：30-10：30、15：30-16：30时）。连续干预4周。20 W可夹式红色电灯用以在抓取动物、行针及灌胃时照明[8]。
1.4 行为学检测
当日首次给药30 min后在大鼠夜周期进行行为学测试。动物分组对动物行为学操作人员设盲，过程中保持周边光线和噪声的一致性；每只大鼠测试完后用75%乙醇及时擦拭迷宫，清除粪便及气味，以免干扰下只大鼠测试。
1.4.1 开场实验
采用内壁100 cm×100 cm×50 cm的木质敞箱，通过软件将箱底设置成25个方格（20 cm×20 cm）。测试开始时将大鼠放在開场箱底部中央，通过视频分析系统自动记录其5 min内总运动距离（cm）、直立次数（大鼠前爪腾空或攀附开场箱侧壁计为1次）、理毛次数及排粪次数。
1.4.2 高架十字迷宫
高架十字迷宫由2个开放臂（30 cm×5 cm）和2个闭合臂（30 cm×5 cm×40 cm）组成，整个设备高于地面50 cm。测试时将大鼠头朝开放臂方向放在四臂交叉的中央区，高架十字迷宫顶部强光源始终打开。记录5 min内活动指标：开放臂进入次数（必须2只前爪进入臂内）、开放臂停留时间、闭合臂进入次数、闭合臂停留时间、高架十字迷宫总进入次数、开放臂进入次数比（开放臂进入次数与迷宫总进入次数比值）、开放臂停留时间比（开放臂进入时间与迷宫总进入时间比值）。
1.4.3 新物体识别实验
新物体识别实验是基于哺乳类动物易趋向于新颖事物的天性而评估学习记忆功能[9]。测试流程分训练期及测试期：在训练期，测试箱内放入形状、颜色及大小相同的2个物体，对称固定于底部对角线上（外1/3处），然后将大鼠背朝两物体（大鼠鼻尖距离两物体的长度一致）放入测试箱3 min，当大鼠嘴部或鼻部朝向物体且在距离物体1 cm范围内时，即被认为探索物体，记录大鼠在此阶段对2个相同物体的探索时间；1 d后进入测试期，将其中一物体换成颜色和形状均不相同但大小相同的新颖物体（保持新物体在测试盒内位置不变），记录5 min内大鼠对新颖物体与熟悉物体的探索时间。采用偏好指数（preference index，PI），即大鼠在训练期探索其中一个物体或测试期探索新物体的时间与探索两物体总时间的比值作为评价大鼠记忆能力的指标。 1.5 单胺类神经递质含量测定
末次给药后1 h，CO2麻醉断头处死大鼠，根据大鼠脑立体定位图，冰台上快速剖取大脑，分离出前额叶皮质，冰生理盐水清洗，滤纸吸干表面水分。称取100 mg左右前额叶皮质，放入1 mL冰冷0.1 mol/L高氯酸溶液（含0.5 mmol /L EDTA、0.01%半胱氨酸）中，冰浴中匀浆离心（4 ℃、3000×g，20 min，取上清液继续离心（室温、12 000×g，3 min），取上清液、以針头式过滤器（0.45 μm）过滤，取滤液以去离子双蒸水1∶4稀释后进行NE、5-HT和DA高效液相-电化学检测。检测条件：色谱柱采用Phenomenex Luna C18反相柱（50 mm×2.0 mm×3 μm），流动相含磷酸二氢钠49.9 mmol/L、EDTA 200 μmol/L、辛烷磺酸钠盐0.2 mmol/L、氯化钠9.9 mmol/L、甲醇100 mL、超纯水（pH 2.6）900 mL，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，工作电压0.7 V。所有数据重复3次。
1.6 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。对数据进行正态分布检验及组间方差齐性检验，符合正态分布且方差齐，组间比较用方差分析，数据不符合正态分布或方差不齐则用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 针刺对SHR大鼠自发性活动的影响
与正常组比较，模型组大鼠总运动距离、直立次数、理毛次数及排粪次数明显增加（P<0.05）；与模型组比较，针刺组和西药组大鼠总运动距离、直立次数及理毛次数明显减少（P<0.05），针刺组大鼠总运动距离少于西药组（P<0.05），两组直立次数比较差异无统计学意义（P>0.05）；各组SHR大鼠排粪次数比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。
2.2 针刺对SHR大鼠冲动行为的影响
各组SHR大鼠进入开放臂次数比及开放臂停留时间比较正常组均明显增加（P<0.05）；西药组及针刺组大鼠开放臂进入次数比及开放臂停留时间比较模型组均明显减少（P<0.05）；针刺组大鼠较西药组开放臂停留时间比明显减少（P<0.05）。结果见表2。
2.3 针刺对SHR大鼠学习记忆能力的影响
在训练期，各组大鼠对2个相同物体探索时间相似（P>0.05），对物体无明显偏好选择。在测试期，各组SHR大鼠PI均明显高于正常组（P<0.05），针刺组大鼠对新物体探索时间较模型组明显增加（P<0.05）。结果见表3。
2.4 针刺对SHR大鼠前额叶皮质中单胺类神经递质的影响
与正常组比较，模型组大鼠DA、NE、5-HT含量明显降低（P<0.05）；与模型组比较，针刺组和西药组大鼠NE、5-HT含量明显增加（P<0.05）。结果见表4。
3 讨论
ADHD属中医学“脏躁”“烦躁”等范畴。《素问·阴阳应象大论篇》谓“阴静阳躁”，即阴主柔静，阳主刚躁，两者充盛和谐，则机体调节功能（如动与静、兴奋与抑制、亢进与减退等）协调无病。小儿ADHD系由阴阳动静失衡而致，即阴静不足，阴不制阳而致神不灵、魂不安、意不固、志不坚。《灵枢·根结》云：“用针之要，在于知调阴与阳。”故针刺治疗ADHD应以头部腧穴及阴经腧穴为主，以期益精填髓、调和阴阳、安神定志。交会穴为多经经气汇聚之处，可起到调诸经的目的。“病变在脑，首取督脉”，而百会为督脉、足太阳、足少阳、手少阳及足厥阴之会，百会又可通过足太阳经的背俞穴与五脏六腑经气相通，取之能填精益髓、疏通脑络、醒神开窍；三阴交为足三阴之会，可通调肝、脾、肾脏腑精气。故合用百会、三阴交治疗ADHD，可达通督调神、益智复聪之功。因此，临床治疗儿童ADHD时多注重对这两穴的应用，以提高疗效。
本实验选择在逆转的暗周期（大鼠清醒周期）里，对动物进行MPH治疗及其他干预，以模仿临床MPH用药方案（ADHD患儿在昼夜节律的“活动期”接受MPH治疗）[10-11]。开场实验的总运动距离、直立次数、理毛次数分别反映动物的自发性活动、对新奇环境的探究程度及情绪紧张程度。本研究发现，针刺可明显减少SHR大鼠在逆转的暗周期运动距离、直立次数及理毛次数，而对同样反映情绪紧张程度的排粪次数没有影响。焦虑相关的冲动采用高架十字迷宫评估，进入开放臂次数及停留时间的增加可能反映了冲动[12-13]，本研究中SHR大鼠进入开放臂次数及停留时间均多于正常组WKY大鼠，表明SHR大鼠可表现出ADHD样的冲动行为；MPH及针刺均能减少SHR大鼠进入开放臂次数及停留时间，针刺更能减少SHR大鼠进入开放臂停留时间，表明针刺较MPH更能减轻SHR大鼠的冲动行为。
有研究发现，3周龄大鼠（品系不详）连续21 d（周末停用）口服MPH3（5 mg/kg，每日2次），大鼠未表现出对新颖物体明显偏好[14]，而Heyser C J等[15]也发现对断乳期（21日龄）和围青春期（34日龄）的SD大鼠连续7 d腹腔注射MPH（5 mg/kg，每日2次），可损伤其识别记忆功能，但因腹腔注射释放药物较迅速，其给药途径对神经系统的影响与药物口服可能不同[16]。而本研究中，西药组与针刺组大鼠对新颖物体PI显著高于模型组，表明长期口服MPH及针刺治疗均可增强SHR大鼠记忆能力，而MPH对SHR大鼠记忆学习能力改善结果与上述报道不同，可能与MPH给药途径、动物品系等不同有关。
ADHD病理机制尚未明确，研究发现脑组织内主要神经递质（如DA、5-HT）与冲动行为的调控有关[17-18]，背侧纹状体DA信号中多巴胺D1受体降低可减轻冲动，青春期长期给予MPH可增强SHR大鼠内侧前额叶皮质中DA转运体功能，而MPH治疗停止后仍可减少成年期细胞外DA的水平[19]。降低的中枢5-HT信号增加大鼠冲动行为及选择，中缝背核5-HT神经元的药理学及光遗传活化可降低选择冲动[20]。学习记忆部分依赖于前额叶皮质的功能整合，其很大程度上依赖于突触DA及NE的最优水平；研究发现，SHR大鼠前额叶皮质中NE释放减少[21]，而MPH被认为可保持DA及NE的水平。可恢复体内儿茶酚胺释放未达最优水平个体的认知功能[22]。本研究中，针刺组及西药组大鼠前额叶皮质中NE、5-HT较模型组明显升高（P<0.05），针刺组大鼠前额叶皮质中DA含量与模型组比较差异无统计学意义，表明针刺“百会”“三阴交”可能通过增加SHR大鼠前额叶皮质中NE、5-HT含量而减轻大鼠夜周期多动及冲动行为、增强大鼠学习记忆能力。 参考文献：
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（收稿日期：2018-03-25）
（修回日期：2018-04-08；編辑：华强）