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【摘 要】 目的：获得氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定金荞麦种子生活力的最佳条件。方法：以染色浓度、染色时间和染色温度为指标，通过正交试验、单因素试验、Central Composite Design响应面分析3种方式进行筛选和优化。结果：TTC浓度0.5 %、染色温度40℃、染色时间4h为最佳测定条件。结论：用正交试验、单因素试验、响应面分析对TTC法测定金荞麦种子生活力的条件进行筛选和优化是可行的。
【关键词】 金荞麦;种子生活力;TTC法;正交试验;单因素试验;响应面分析
【中图分类号】R284 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2021）1-0026-05
Optimization of Seed Vigor Test Conditions by TTC Method in Fagopyrum dibotry
TAN Longyan WU Yilin MA Hongna
School of Pharmaceutical Sciences， Guizhou University of Traditional Chinese medicine， Guiyang 550025， China
Abstract：Objective To obtain the best conditions for determination of seed viability of Fagopyrum dibotry by 2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride （TTC） method. Methods The samples with dyeing concentration， dyeing time and dyeing temperature as indexes， and orthogonal test， single factor test and Central Composite Design response surface analysis were used to select and optimize. Results TTC concentration 0.5%， dyeing temperature 40 ℃ and dyeing time 4 h were the best conditions. Conclusion It is feasible to select and optimize the conditions of TTC method to determine Fagopyrum dibotry seed viability by orthogonal test， single factor test and response surface analysis.
Keywords：Fagopyrum Dibotry; Seed Viability; TTC Method; Orthogonal Test; Single Factor Test; Central Composite Design Response Surface Analysis
金荞麦（Fagopyrum dibotry）为蓼科荞麦属（Fagopyrum）多年生草本植物，以干燥根茎入药[1-2]。现代药理学[3]研究表明金荞麦根据具有抗炎镇痛、抗氧化、抗肿瘤、抗菌和增强免疫力的作用，在临床上能够治疗呼吸系统疾病、肠道系统疾病和肿瘤等。同时，金荞麦种子中富含蛋白质、脂类和维生素等，具有较高的营养价值和保健作用[4]。此外，金荞麦茎叶为牛羊等牲畜喜食，是一种优良牧草[5]。因此，金荞麦为一种具有较高经济价值的资源植物。种子是种子植物的繁殖体，也是植被恢复和重建的物质基础，而种子的生活力检测是预判种子是否具有繁殖价值的重要手段[6]。本研究采用正交试验、单因素试验和Central Composite Design 响应面试验对 TTC 法测定金荞麦种子生活力的条件进行筛选和优化，以期种子为生物学研究和规模化生产提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 材料 金荞麦种子采自贵州中医药大学药学院种植资源圃，经贵州中医药大学药学院檀龙颜副教授鉴定为金荞麦（Fagopyrum dibotrys）种子，采种后阴干，于4℃保存备用。测定试剂为氯化三苯基四氮唑（TTC） 。
1.2 方法
1.2.1 种子处理 种子浸泡：将去除杂质，种皮无破损的金荞麦种子置于烧杯中浸泡24h后，从种子中间切断，将胚切面较完整的每50个半粒种子置于直径9cm的培养皿中进行后续实验。种子染色：方法同马洪娜等[6]。
1.2.2 正交试验 选取TTC浓度（A） （0.3%、0.5%、0.7%）、染色温度（B）（35℃、40℃、45℃）、染色时间（C）（2h、3h、4h）3个因素的不同水平，每组50个半粒种子，通过正交表设计正交试验。
1.2.3 单因素试验 ①染色时间试验：取50个金荞麦半粒种子，TTC浓度设置为0.5%，温度设置为40℃，时间设置1h、2h、3h、4h、5h和5个水平;②染色温度试验：取50个金荞麦半粒种子，TTC浓度设置为0.5%，时间设置为4h，温度设置30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等5个水平;③染色TTC浓度试验：取50个金荞麦半粒种子，温度设置为40℃，时间设置为4h，TTC浓度设置为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%等5个水平。
1.2.4 响应面试验 以TTC浓度（A）、染色溫度（B）、染色时间（C）为变量，依据Central Composite Design设计原理，设计3因素5水平试验。每个处理50个金荞麦半粒种子。以种子生活力为响应值（Y）进行响应面分析。 1.3 数据分析 种子生活力根据染色颜色的深浅和比率计算，利用SPSS17.0软件和Design Expert 8.0.6软件进行数据分析，P<0.05表示差异具有统计学意义，P<0.01表示差异具有高度统计学意义，每组试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 正交试验结果 由表1可知，组合为TTC浓度0.3%，染色温度35℃，染色时间2h的金荞麦种子生活力最低（59.3%）， 组合染色温度40℃，TTC浓度0.5%，染色时间3h种子生活力最高（85.2%）。方差分析结果显示，因素TTC染色浓度差异显著，染色温度和染色时间均差异不显著（表2）。
2.2 单因素试验结果 从表3可以看出，随着染色时间增加，颜色由黄色到粉色再到深红色，1～ 4h种子生活力逐渐增加，5h时种子生活力显著降低，种子活力最高为染色4h。因此，金荞麦种子生活力TTC单因素试验法的最佳染色时间选择为4h。
当TTC浓度从0.1 % ～ 0.5 %时，金荞麦种子的生活力逐渐增大，染色颜色由浅粉色到粉色、红色，其中TTC浓度为0.5%时最大。当TTC浓度为0.7%时和0.9%时，染色颜色为深红色，但种子的活力下降下降。因此，金荞麦种子生活力TTC单因素试验法的最佳TTC浓度为0.5%（表 4）。
染色温度为30℃ ～ 40℃之间的金荞麦种子，种子生活力逐渐增大，胚颜色由浅粉色到浅红色和红色。当温度超过40℃时，种子生活力反而随着温度的升高而降低，胚颜色也从黄白色至白色，说明种子并没有被TTC染色。因此，金荞麦种子生活力TTC单因素试验法最佳温度为40℃（表 5）。
基于以上的3个单因素试验结果，金荞麦种子生活力TTC测定法的单因素试验中，TTC浓度（0.5%）×染色温度（40℃）×染色时间（4h）为最佳条件，该结果与正交试验结果相近。
2.3 响应面优化
2.3.1 模型的建立与分析 根据Central Composite Design试验设计及结果分析见表6，将表6结果数据进行多元回归分析，分析结果见表7。回归分析得回归方程：Y=+86.79+0.35A-3.04B+1.96C-6.96AB-0.46AC-3.39BC-10.36A2-5.64B2-2.44C2。模型的F值为16.37，且P<0.0001，表明模型差异极显著。校正决定系数R2adj=0.9848，相关系数R2=0.9424，表明该模型的拟合度较好，可用于种子生活力的理论预测。模型的变异系数为5.45%（<10%），表明模型稳定性良好，试验操作可靠。模型的信噪比为10.315（>4），表明该模型能真实地反映试验结果。
模型系数的显著性检验表明，3个因素对金荞麦种子生活力测定影响差异极显著，且各因素的影响顺序为染色温度>染色时间>TTC浓度。
2.3.2 响应面分析 响应面试验法中，响应面图曲面坡度的陡峭程度，能直观体现各两个因素的交互作用对种子生活力响应值的影响。其中，染色温度与TTC浓度的交互作用对响应值影响最大（图1），响应面的倾斜度最高，其次是TTC浓度与染色时间（图2），最后是染色温度与染色时间（图3）。通过响应面法优化，试验组TTC浓度（0.5%）×染色温度（40℃）×染色时间（4 h）是金荞麦种子生活力TTC法测定的最佳条件，此组合下，理论种子生活力为87.8%。在此条件下，进行验证，重復3次，实测生活力为86.72%、86.93%、86.7%，平均生活力为86.78%。试验生活力测定值与理论预测值的误差为1.02%（<5%），因此，应用Design-Expert中的Central Composite Design响应面设计优化金荞麦种子TTC法测定条件是可行的。
3 讨论
3.1 利用响应面优化能得到较为精确的试验参数 尽管正交试验能够减少工作量，且具有高效、快速和经济等优势，但是正交试验的优选结果不会超越所取水平的范围，不是很精确。单因素讲究效率，但是筛选的参数范围不是很精确。因此，无论是单因素试验还是正交试验都有一定的缺限。而本试验种响应面分析优化金荞麦种子生活力测定的最佳条件为TTC浓度（0.5 %）×染色温度（40℃）× 染色时间（4h），与正交试验和单因素试验的结果相近或一致。表明单因素试验与正交试验结合，同时利用响应面法优化，则能得到较为可靠的试验参数。
3.2 响应面分析法能在更广阔的领域应用 响应面分析法利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题，一般在工程类工艺设计中应用较为广泛。农业生产方面，头花蓼种子[7]和羊耳菊种子[8]，以及山豆根种子[6， 9]生活力测定中，通过响应面分析优化相应测定条件已获得了较好的结论，且本文结果也表明利用响应面分析优化金荞麦种子生活力测定条件是可行的。因此，响应面分析法的应用面较广，可在农业生产领域应用。
参考文献
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志（第25卷，第一分册）[M]. 北京： 科学出版社， 1985 ： 111-112.
[2]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S]. 一部. 北京： 中国医药科技出版社， 2015 ： 218.
[3]严晶， 袁嘉嘉， 刘丽娜， 等. 金荞麦药理作用及临床应用研究进展[J]. 山东中医杂志， 2017， 36（7） ： 621-624.
[4]吴清， 梁国鲁. 金荞麦野生资源的开发与利用. 中国野生植物资源[J]， 2001， 20（2） ： 27-28.
[5]赵丽丽， 王普昶， 陈超， 等.持续干旱对金荞麦生长、生理生态特性的影响及抗旱性评价[J]. 草地学报， 2016， 24（4） ： 825-833.
[6]马洪娜， 吴依琳， 何 雨， 等. TTC 法测定山豆根种子生活力条件的优化[J]. 种子， 2019， 38（9） ： 43-47.
[7]王志威， 魏升华， 李俊， 等. 头花蓼种子生活力TTC法最优测定条件研究[J]. 南方农业， 2018， 12（25） ： 1-6.
[8]成小璐， 魏怡冰， 魏升华， 等. 羊耳菊种子生活力的最佳测定条件[J]. 贵州农业科学， 2016， 44（8） ：100-104.
[9]檀龙颜， 吴月君， 何雨. 溴麝香草酚蓝法测定山豆根种子生活力的条件优化研究[J]. 现代农业科技， 2020，（6） ： 74-75，79.
（收稿日期：2020-07-03 编辑：陶希睿）
【关键词】 金荞麦;种子生活力;TTC法;正交试验;单因素试验;响应面分析
【中图分类号】R284 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2021）1-0026-05
Optimization of Seed Vigor Test Conditions by TTC Method in Fagopyrum dibotry
TAN Longyan WU Yilin MA Hongna
School of Pharmaceutical Sciences， Guizhou University of Traditional Chinese medicine， Guiyang 550025， China
Abstract：Objective To obtain the best conditions for determination of seed viability of Fagopyrum dibotry by 2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride （TTC） method. Methods The samples with dyeing concentration， dyeing time and dyeing temperature as indexes， and orthogonal test， single factor test and Central Composite Design response surface analysis were used to select and optimize. Results TTC concentration 0.5%， dyeing temperature 40 ℃ and dyeing time 4 h were the best conditions. Conclusion It is feasible to select and optimize the conditions of TTC method to determine Fagopyrum dibotry seed viability by orthogonal test， single factor test and response surface analysis.
Keywords：Fagopyrum Dibotry; Seed Viability; TTC Method; Orthogonal Test; Single Factor Test; Central Composite Design Response Surface Analysis
金荞麦（Fagopyrum dibotry）为蓼科荞麦属（Fagopyrum）多年生草本植物，以干燥根茎入药[1-2]。现代药理学[3]研究表明金荞麦根据具有抗炎镇痛、抗氧化、抗肿瘤、抗菌和增强免疫力的作用，在临床上能够治疗呼吸系统疾病、肠道系统疾病和肿瘤等。同时，金荞麦种子中富含蛋白质、脂类和维生素等，具有较高的营养价值和保健作用[4]。此外，金荞麦茎叶为牛羊等牲畜喜食，是一种优良牧草[5]。因此，金荞麦为一种具有较高经济价值的资源植物。种子是种子植物的繁殖体，也是植被恢复和重建的物质基础，而种子的生活力检测是预判种子是否具有繁殖价值的重要手段[6]。本研究采用正交试验、单因素试验和Central Composite Design 响应面试验对 TTC 法测定金荞麦种子生活力的条件进行筛选和优化，以期种子为生物学研究和规模化生产提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 材料 金荞麦种子采自贵州中医药大学药学院种植资源圃，经贵州中医药大学药学院檀龙颜副教授鉴定为金荞麦（Fagopyrum dibotrys）种子，采种后阴干，于4℃保存备用。测定试剂为氯化三苯基四氮唑（TTC） 。
1.2 方法
1.2.1 种子处理 种子浸泡：将去除杂质，种皮无破损的金荞麦种子置于烧杯中浸泡24h后，从种子中间切断，将胚切面较完整的每50个半粒种子置于直径9cm的培养皿中进行后续实验。种子染色：方法同马洪娜等[6]。
1.2.2 正交试验 选取TTC浓度（A） （0.3%、0.5%、0.7%）、染色温度（B）（35℃、40℃、45℃）、染色时间（C）（2h、3h、4h）3个因素的不同水平，每组50个半粒种子，通过正交表设计正交试验。
1.2.3 单因素试验 ①染色时间试验：取50个金荞麦半粒种子，TTC浓度设置为0.5%，温度设置为40℃，时间设置1h、2h、3h、4h、5h和5个水平;②染色温度试验：取50个金荞麦半粒种子，TTC浓度设置为0.5%，时间设置为4h，温度设置30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等5个水平;③染色TTC浓度试验：取50个金荞麦半粒种子，温度设置为40℃，时间设置为4h，TTC浓度设置为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%等5个水平。
1.2.4 响应面试验 以TTC浓度（A）、染色溫度（B）、染色时间（C）为变量，依据Central Composite Design设计原理，设计3因素5水平试验。每个处理50个金荞麦半粒种子。以种子生活力为响应值（Y）进行响应面分析。 1.3 数据分析 种子生活力根据染色颜色的深浅和比率计算，利用SPSS17.0软件和Design Expert 8.0.6软件进行数据分析，P<0.05表示差异具有统计学意义，P<0.01表示差异具有高度统计学意义，每组试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 正交试验结果 由表1可知，组合为TTC浓度0.3%，染色温度35℃，染色时间2h的金荞麦种子生活力最低（59.3%）， 组合染色温度40℃，TTC浓度0.5%，染色时间3h种子生活力最高（85.2%）。方差分析结果显示，因素TTC染色浓度差异显著，染色温度和染色时间均差异不显著（表2）。
2.2 单因素试验结果 从表3可以看出，随着染色时间增加，颜色由黄色到粉色再到深红色，1～ 4h种子生活力逐渐增加，5h时种子生活力显著降低，种子活力最高为染色4h。因此，金荞麦种子生活力TTC单因素试验法的最佳染色时间选择为4h。
当TTC浓度从0.1 % ～ 0.5 %时，金荞麦种子的生活力逐渐增大，染色颜色由浅粉色到粉色、红色，其中TTC浓度为0.5%时最大。当TTC浓度为0.7%时和0.9%时，染色颜色为深红色，但种子的活力下降下降。因此，金荞麦种子生活力TTC单因素试验法的最佳TTC浓度为0.5%（表 4）。
染色温度为30℃ ～ 40℃之间的金荞麦种子，种子生活力逐渐增大，胚颜色由浅粉色到浅红色和红色。当温度超过40℃时，种子生活力反而随着温度的升高而降低，胚颜色也从黄白色至白色，说明种子并没有被TTC染色。因此，金荞麦种子生活力TTC单因素试验法最佳温度为40℃（表 5）。
基于以上的3个单因素试验结果，金荞麦种子生活力TTC测定法的单因素试验中，TTC浓度（0.5%）×染色温度（40℃）×染色时间（4h）为最佳条件，该结果与正交试验结果相近。
2.3 响应面优化
2.3.1 模型的建立与分析 根据Central Composite Design试验设计及结果分析见表6，将表6结果数据进行多元回归分析，分析结果见表7。回归分析得回归方程：Y=+86.79+0.35A-3.04B+1.96C-6.96AB-0.46AC-3.39BC-10.36A2-5.64B2-2.44C2。模型的F值为16.37，且P<0.0001，表明模型差异极显著。校正决定系数R2adj=0.9848，相关系数R2=0.9424，表明该模型的拟合度较好，可用于种子生活力的理论预测。模型的变异系数为5.45%（<10%），表明模型稳定性良好，试验操作可靠。模型的信噪比为10.315（>4），表明该模型能真实地反映试验结果。
模型系数的显著性检验表明，3个因素对金荞麦种子生活力测定影响差异极显著，且各因素的影响顺序为染色温度>染色时间>TTC浓度。
2.3.2 响应面分析 响应面试验法中，响应面图曲面坡度的陡峭程度，能直观体现各两个因素的交互作用对种子生活力响应值的影响。其中，染色温度与TTC浓度的交互作用对响应值影响最大（图1），响应面的倾斜度最高，其次是TTC浓度与染色时间（图2），最后是染色温度与染色时间（图3）。通过响应面法优化，试验组TTC浓度（0.5%）×染色温度（40℃）×染色时间（4 h）是金荞麦种子生活力TTC法测定的最佳条件，此组合下，理论种子生活力为87.8%。在此条件下，进行验证，重復3次，实测生活力为86.72%、86.93%、86.7%，平均生活力为86.78%。试验生活力测定值与理论预测值的误差为1.02%（<5%），因此，应用Design-Expert中的Central Composite Design响应面设计优化金荞麦种子TTC法测定条件是可行的。
3 讨论
3.1 利用响应面优化能得到较为精确的试验参数 尽管正交试验能够减少工作量，且具有高效、快速和经济等优势，但是正交试验的优选结果不会超越所取水平的范围，不是很精确。单因素讲究效率，但是筛选的参数范围不是很精确。因此，无论是单因素试验还是正交试验都有一定的缺限。而本试验种响应面分析优化金荞麦种子生活力测定的最佳条件为TTC浓度（0.5 %）×染色温度（40℃）× 染色时间（4h），与正交试验和单因素试验的结果相近或一致。表明单因素试验与正交试验结合，同时利用响应面法优化，则能得到较为可靠的试验参数。
3.2 响应面分析法能在更广阔的领域应用 响应面分析法利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题，一般在工程类工艺设计中应用较为广泛。农业生产方面，头花蓼种子[7]和羊耳菊种子[8]，以及山豆根种子[6， 9]生活力测定中，通过响应面分析优化相应测定条件已获得了较好的结论，且本文结果也表明利用响应面分析优化金荞麦种子生活力测定条件是可行的。因此，响应面分析法的应用面较广，可在农业生产领域应用。
参考文献
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[9]檀龙颜， 吴月君， 何雨. 溴麝香草酚蓝法测定山豆根种子生活力的条件优化研究[J]. 现代农业科技， 2020，（6） ： 74-75，79.
（收稿日期：2020-07-03 编辑：陶希睿）