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摘要：目的 探讨重症急性胰腺炎大鼠舌组织水通道蛋白3（AQP3）的表达及大黄素的调节作用。方法 采用5%牛磺胆酸钠逆行胆胰管注入制作大鼠急性重症胰腺炎模型。将SD雄性大鼠随机分成假手术组、模型组、大黄素组，大黄素组于造模后每日予大黄素20 mg/kg灌胃，模型组及假手术组予等量生理盐水灌胃。造模后每日观察大鼠精神状态、厚腻苔出现情况及存活率；造模第5日后各组随机选取8只大鼠处死，留取标本，采用Western blot和实时定量PCR检测舌组织AQP3蛋白及基因表达。结果 与模型组比较，大黄素组大鼠死亡率、厚腻苔发生率降低及厚腻苔发生明显减少，AQP3蛋白及基因表达明显降低（P<0.05）。至实验第5日，模型组存活11只大鼠，出现厚腻苔5只；与假手术组比较，模型组大鼠舌组织AQP3蛋白及基因表达均明显升高（P<0.05）。结论 大黄素通过下调AQP3蛋白及基因表达，改善重症急性胰腺炎大鼠症状，减少厚腻苔的发生。
关键词：胰腺炎；大黄素；水通道蛋白3；基因表达；蛋白表达；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0069-04
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis， SAP）是临床常见危重病之一。临床观察发现，近半数表现为肝脾湿热证[1]。前期研究表明，SAP大鼠在病情发展过程中可部分出现舌苔厚腻的“湿”象，血管通透性增高能促进厚腻苔的发生[2]。水通道蛋白3（AQP3）是与水及甘油等小分子通透性有关的转运蛋白，广泛表达于消化道上皮细胞，研究表明，AQP3异常表达可引起黏膜通透性的改变[3-4]。本研究观察大黄素干预治疗对SAP大鼠厚腻苔及舌组织AQP3表达的影响及其可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠，体质量（200±50）g，解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK（军） 2007-0004。
1.2 药物、试剂与仪器
大黄素，昆明风山渐医药研究有限公司；牛磺胆酸钠，美国Amresco公司；兔抗AQP3多克隆抗体 （1∶1000），英国Abcam公司，β肌动蛋白（β-actin， 1∶1000）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗 （1∶3000），美国Santa Cruz公司。二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（SUNBIO），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），cDNA反转录试剂盒（Applied Biosystems，美国）。Smartspec plus核酸蛋白测定仪（美国Bio-Rad公司），RT-PCR system（美国ABI公司），高速低温离心机Sigma 3K-18（美国Sigma公司），紫外分光光度计U-2001 UV/VIS（日本东芝），凝胶成像仪及Icycler PCR仪（美国Bio-Rad公司）。
1.3 分组、造模与给药
入选大鼠共45只，随机分为模型组（20只）、大黄素组（15只）、假手术组（10只）。采用胰胆管逆行匀速注入牛磺胆酸钠（1 mL/kg）的方法制备大鼠SAP模型[5]。大黄素组于术后即予灌胃，每次10 mg/kg，模型组和假手术组予等量生理盐水灌胃。2次/d，连续4 d。
1.4 标本制备
造模后第5日，每组随机选取8只大鼠，麻醉后心脏取血，留取舌组织（舌中部接近中线位置），分别以多聚甲醛水溶液固定，液氮保存备用。
1.5 指标检测
1.5.1 一般观察 造模后每日观察大鼠精神状态、舌质、舌苔等证象，并记录死亡情况。
1.5.2 舌组织水通道蛋白3蛋白表达检测 采用Western blot检测舌组织AQP3蛋白。按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明书步骤操作，根据标准曲线计算出蛋白浓度。一抗及二抗孵育后DAB显色、ECL曝光，并用LabWorks软件对图像进行灰度分析。
1.5.3 大鼠舌组织水通道蛋白3基因表达检测 采用RT-PCR检测舌组织中AQP3基因表达。Trizol试剂提取各组舌组织总RNA，并以紫外吸收法定量。随后，cDNA反转录按试剂盒说明书步骤操作。引物由北京赛百盛公司设计：AQP3（上游5'-ACCTCCATGGGCTTC AATTCT-3'，下游5'-AGTGAAAAGGCGAGGTCCAA-3）；GAPDH（上游5'-CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCA-3'，下游5'-CTTCCCATTCTCAGCCTTGACT-3'）。反应体系为20 μL，内参照基因为大鼠GAPDH。采用相对定量2-ΔΔCt值方法分析。设定标准对照品基因表达为1。
1.6 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析及q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大黄素对重症急性胰腺炎大鼠舌苔的影响
模型组：术后大鼠现倦怠，耸毛，部分大鼠出现便溏，至第5日存活11只大鼠中出现厚（黄或白）腻苔5只。大黄素组：大鼠麻醉苏醒后活动略减少，至次日活动、饮食均明显好转，倦怠逐渐减轻，大便呈黄稀便，至第5日，大鼠共存活12只，仅2只大鼠出现厚（黄或白）腻苔，显著低于模型组。表明大黄素可明显减少SAP大鼠厚腻苔的发生。假手术组：大鼠麻醉苏醒后活动略减少，次日开始即饮食、活动基本正常，无倦怠、耸毛，大便正常，未现便溏；舌苔与正常大鼠比较无明显变化。
2.2 大黄素对重症急性胰腺炎大鼠存活率的影响
至实验第5日，模型组大鼠存活11只（存活率为55%），大黄素组大鼠存活12只（存活率为80%），存活率明显高于模型组，见图1。提示大黄素可明显改善SAP大鼠预后。 2.3 大黄素对重症急性胰腺炎大鼠舌组织水通道蛋白3蛋白表达的影响
模型组大鼠舌组织中AQP3蛋白表达明显高于假手术组（P<0.05）；与模型组比较，大黄素组AQP3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。见图2。
2.4 大黄素对重症急性胰腺炎大鼠舌组织水通道蛋白3基因表达的影响
与假手术组比较，模型组和大黄素组大鼠舌组织中AQP3 mRNA明显升高（P<0.05），但2组比较差异无统计学意义。见图3。
3 讨论
中医学认为，急性胰腺炎与肝、胆、脾、胃、大肠等脏腑密切相关，由于饮食不节、恣食膏粱厚味、情志不畅、蛔虫窜扰等致肝胆脾胃功能失职，湿、热、毒、瘀蕴结中焦，气机升降失调而致病。唐氏等[1]观察临床51例急性胰腺炎患者，其中17例表现为肝脾湿热型，舌苔厚腻。而本实验也发现SAP大鼠造模第5日厚腻苔的出现率明显增多。
大黄素是从大黄中提纯的蒽醌类衍生物，现代研究表明，大黄素具有抑酶、抑菌、导泻、解除括约肌痉挛作用等[6-8]。我们前期研究发现，大黄素能明显改善SAP大鼠胰腺病理破坏，降低血淀粉酶水平，改善预后[9]。本研究显示，大黄素可降低SAP大鼠死亡率，对SAP的治疗作用与前期研究及相关文献报道一致[8，10]。
现代研究表明，湿热证病理生理中，水湿停滞、潴溜于体内是主要的临床改变之一。脾胃湿热证大鼠模型可见，湿偏重者脾脏血窦周围内皮细胞明显水肿；温病湿热证湿重于热动物模型舌固有层水肿明显[11]。由此可见，水液代谢失衡在湿热证的病理生理过程中起着重要的作用。鉴于腻苔是湿证的特征性舌苔，提示腻苔的形成与水湿停滞、潴留于体内可能有关。
AQPs是细胞膜上的一种与水的通透性有关的转运蛋白。已有研究显示，脾胃湿热证患者胃黏膜AQP3、AQP4基因和蛋白表达水平显著高于正常对照组，中药清热化湿方可显著降低二者的蛋白和基因表达水平[12]。本研究通过Western blot、实时定量PCR分析发现，SAP大鼠舌组织中AQP3蛋白及基因表达均明显升高。鉴于AQP3是一种小分子物质通透性相关的转运蛋白，其水平升高可增加小分子物质的通透，引起水湿停滞，故推测AQP3与SAP大鼠湿证的发生及厚腻苔形成可能有关。
大黄能促进胃肠蠕动，防治麻痹性肠梗阻，促进肠道内毒素排泄，保持肠道微生态平衡，并且能降低肠黏膜通透性，抑制肠道细菌及内毒素移位等作用。我们的前期研究结果提示，AQP3参与了SAP的病理生理改变，考虑为肠黏膜通透性增高的机制之一[10]；大黄素治疗使AQP3蛋白及基因表达下降，可能与大黄素治疗SAP时降低肠黏膜通透性有关。本研究结果发现，大黄素可明显下调SAP大鼠舌组织AQP3的蛋白及基因表达，同时，大黄素治疗后厚腻苔的发生也明显减少，其机制可能是通过下调AQP3蛋白及基因表达，减少水的通透性，还有待进一步探讨。
参考文献：
[1] 唐文富，万美华，朱林，等.急性胰腺炎免疫及CD95变化与中医辨证分型相关性研究[J].成都中医药大学学报，2004，27（4）：9-10.
[2] Qi Wen-jie， Zhang Miao-miao， Wang Hong， et al. Research on the relationship between thick greasy tongue fur formation and vascular endothelial cell permeability with the protein expression of Zonula Occludens-1[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine，2011，17（7）：510-516.
[3] Delgado M Valdez Jr， Takao Hara， Akira Miyamoto， et al. Expression of aquaporin-3 improves the permeability to water and cryoprotectants of immature oocytes in the medaka （Oryzias latipes）[J]. Cryobiology，2006，53：160-168.
[4] Ma T， Song Y， Yang B， et al. Nephrogenic diabetes insipidus in mice lacking aquaporin-3 water channels[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2000，97：4386-4391.
[5] Abe N， Watanabe T， Ozawa S， et al. Pancreatic endocrine function and glucose transporter （GLUT） 22 expression in rat acute pancreatitis[J]. Pancreas，2002，25（2）：149-153.
[6] 刘瑞林，刘牧林，马良龙.大黄素对重症胰腺炎大鼠核转录因子-κB表达变化的影响[J].中国中西医结合急救杂志，2005，12（4）：230-232.
[7] 李新字，景炳文，陈德吕，等.大黄对大鼠肠缺血/再灌注所致肺损伤过 程肿瘤坏死因子、一氧化氮和磷脂酶A2的影响[J].中国危重病急救医学，1999，11（2）：71-75.
[8] 王婧，阴赪宏，路琴，等.大黄素对重症急性胰腺炎大鼠血清瘦素的影响[J].中华急诊医学杂志，2007，16（11）：1141-1145.
[9] 齐文杰，张淑文，王红，等.急性重症胰腺炎湿热证动物模型建立初探[J].中国中医药信息杂志，2011，18（2）：47-50.
[10] 齐文杰，张淑文，王红，等.大黄素对重症急性胰腺炎大鼠小肠水通道蛋白3表达的调节作用[J].中国中西医结合急救杂志，2010，17（4）：214- 217.
[11] 文小敏，廖荣鑫，彭胜权，等.脾胃湿热证湿偏重、热偏重型大鼠模型脾脏超微结构观察[J].新中医，2008，40（3）：93-94.
[12] 陈更新，劳绍贤，黄志新，等.中药对脾胃湿热证患者胃粘膜水通道蛋白3、4基因表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2005，25（3）：199-202.
（收稿日期：2014-10-10；编辑：华强）
关键词：胰腺炎；大黄素；水通道蛋白3；基因表达；蛋白表达；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0069-04
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis， SAP）是临床常见危重病之一。临床观察发现，近半数表现为肝脾湿热证[1]。前期研究表明，SAP大鼠在病情发展过程中可部分出现舌苔厚腻的“湿”象，血管通透性增高能促进厚腻苔的发生[2]。水通道蛋白3（AQP3）是与水及甘油等小分子通透性有关的转运蛋白，广泛表达于消化道上皮细胞，研究表明，AQP3异常表达可引起黏膜通透性的改变[3-4]。本研究观察大黄素干预治疗对SAP大鼠厚腻苔及舌组织AQP3表达的影响及其可能机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠，体质量（200±50）g，解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK（军） 2007-0004。
1.2 药物、试剂与仪器
大黄素，昆明风山渐医药研究有限公司；牛磺胆酸钠，美国Amresco公司；兔抗AQP3多克隆抗体 （1∶1000），英国Abcam公司，β肌动蛋白（β-actin， 1∶1000）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗 （1∶3000），美国Santa Cruz公司。二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（SUNBIO），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），cDNA反转录试剂盒（Applied Biosystems，美国）。Smartspec plus核酸蛋白测定仪（美国Bio-Rad公司），RT-PCR system（美国ABI公司），高速低温离心机Sigma 3K-18（美国Sigma公司），紫外分光光度计U-2001 UV/VIS（日本东芝），凝胶成像仪及Icycler PCR仪（美国Bio-Rad公司）。
1.3 分组、造模与给药
入选大鼠共45只，随机分为模型组（20只）、大黄素组（15只）、假手术组（10只）。采用胰胆管逆行匀速注入牛磺胆酸钠（1 mL/kg）的方法制备大鼠SAP模型[5]。大黄素组于术后即予灌胃，每次10 mg/kg，模型组和假手术组予等量生理盐水灌胃。2次/d，连续4 d。
1.4 标本制备
造模后第5日，每组随机选取8只大鼠，麻醉后心脏取血，留取舌组织（舌中部接近中线位置），分别以多聚甲醛水溶液固定，液氮保存备用。
1.5 指标检测
1.5.1 一般观察 造模后每日观察大鼠精神状态、舌质、舌苔等证象，并记录死亡情况。
1.5.2 舌组织水通道蛋白3蛋白表达检测 采用Western blot检测舌组织AQP3蛋白。按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明书步骤操作，根据标准曲线计算出蛋白浓度。一抗及二抗孵育后DAB显色、ECL曝光，并用LabWorks软件对图像进行灰度分析。
1.5.3 大鼠舌组织水通道蛋白3基因表达检测 采用RT-PCR检测舌组织中AQP3基因表达。Trizol试剂提取各组舌组织总RNA，并以紫外吸收法定量。随后，cDNA反转录按试剂盒说明书步骤操作。引物由北京赛百盛公司设计：AQP3（上游5'-ACCTCCATGGGCTTC AATTCT-3'，下游5'-AGTGAAAAGGCGAGGTCCAA-3）；GAPDH（上游5'-CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCA-3'，下游5'-CTTCCCATTCTCAGCCTTGACT-3'）。反应体系为20 μL，内参照基因为大鼠GAPDH。采用相对定量2-ΔΔCt值方法分析。设定标准对照品基因表达为1。
1.6 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析及q检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大黄素对重症急性胰腺炎大鼠舌苔的影响
模型组：术后大鼠现倦怠，耸毛，部分大鼠出现便溏，至第5日存活11只大鼠中出现厚（黄或白）腻苔5只。大黄素组：大鼠麻醉苏醒后活动略减少，至次日活动、饮食均明显好转，倦怠逐渐减轻，大便呈黄稀便，至第5日，大鼠共存活12只，仅2只大鼠出现厚（黄或白）腻苔，显著低于模型组。表明大黄素可明显减少SAP大鼠厚腻苔的发生。假手术组：大鼠麻醉苏醒后活动略减少，次日开始即饮食、活动基本正常，无倦怠、耸毛，大便正常，未现便溏；舌苔与正常大鼠比较无明显变化。
2.2 大黄素对重症急性胰腺炎大鼠存活率的影响
至实验第5日，模型组大鼠存活11只（存活率为55%），大黄素组大鼠存活12只（存活率为80%），存活率明显高于模型组，见图1。提示大黄素可明显改善SAP大鼠预后。 2.3 大黄素对重症急性胰腺炎大鼠舌组织水通道蛋白3蛋白表达的影响
模型组大鼠舌组织中AQP3蛋白表达明显高于假手术组（P<0.05）；与模型组比较，大黄素组AQP3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。见图2。
2.4 大黄素对重症急性胰腺炎大鼠舌组织水通道蛋白3基因表达的影响
与假手术组比较，模型组和大黄素组大鼠舌组织中AQP3 mRNA明显升高（P<0.05），但2组比较差异无统计学意义。见图3。
3 讨论
中医学认为，急性胰腺炎与肝、胆、脾、胃、大肠等脏腑密切相关，由于饮食不节、恣食膏粱厚味、情志不畅、蛔虫窜扰等致肝胆脾胃功能失职，湿、热、毒、瘀蕴结中焦，气机升降失调而致病。唐氏等[1]观察临床51例急性胰腺炎患者，其中17例表现为肝脾湿热型，舌苔厚腻。而本实验也发现SAP大鼠造模第5日厚腻苔的出现率明显增多。
大黄素是从大黄中提纯的蒽醌类衍生物，现代研究表明，大黄素具有抑酶、抑菌、导泻、解除括约肌痉挛作用等[6-8]。我们前期研究发现，大黄素能明显改善SAP大鼠胰腺病理破坏，降低血淀粉酶水平，改善预后[9]。本研究显示，大黄素可降低SAP大鼠死亡率，对SAP的治疗作用与前期研究及相关文献报道一致[8，10]。
现代研究表明，湿热证病理生理中，水湿停滞、潴溜于体内是主要的临床改变之一。脾胃湿热证大鼠模型可见，湿偏重者脾脏血窦周围内皮细胞明显水肿；温病湿热证湿重于热动物模型舌固有层水肿明显[11]。由此可见，水液代谢失衡在湿热证的病理生理过程中起着重要的作用。鉴于腻苔是湿证的特征性舌苔，提示腻苔的形成与水湿停滞、潴留于体内可能有关。
AQPs是细胞膜上的一种与水的通透性有关的转运蛋白。已有研究显示，脾胃湿热证患者胃黏膜AQP3、AQP4基因和蛋白表达水平显著高于正常对照组，中药清热化湿方可显著降低二者的蛋白和基因表达水平[12]。本研究通过Western blot、实时定量PCR分析发现，SAP大鼠舌组织中AQP3蛋白及基因表达均明显升高。鉴于AQP3是一种小分子物质通透性相关的转运蛋白，其水平升高可增加小分子物质的通透，引起水湿停滞，故推测AQP3与SAP大鼠湿证的发生及厚腻苔形成可能有关。
大黄能促进胃肠蠕动，防治麻痹性肠梗阻，促进肠道内毒素排泄，保持肠道微生态平衡，并且能降低肠黏膜通透性，抑制肠道细菌及内毒素移位等作用。我们的前期研究结果提示，AQP3参与了SAP的病理生理改变，考虑为肠黏膜通透性增高的机制之一[10]；大黄素治疗使AQP3蛋白及基因表达下降，可能与大黄素治疗SAP时降低肠黏膜通透性有关。本研究结果发现，大黄素可明显下调SAP大鼠舌组织AQP3的蛋白及基因表达，同时，大黄素治疗后厚腻苔的发生也明显减少，其机制可能是通过下调AQP3蛋白及基因表达，减少水的通透性，还有待进一步探讨。
参考文献：
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[7] 李新字，景炳文，陈德吕，等.大黄对大鼠肠缺血/再灌注所致肺损伤过 程肿瘤坏死因子、一氧化氮和磷脂酶A2的影响[J].中国危重病急救医学，1999，11（2）：71-75.
[8] 王婧，阴赪宏，路琴，等.大黄素对重症急性胰腺炎大鼠血清瘦素的影响[J].中华急诊医学杂志，2007，16（11）：1141-1145.
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[11] 文小敏，廖荣鑫，彭胜权，等.脾胃湿热证湿偏重、热偏重型大鼠模型脾脏超微结构观察[J].新中医，2008，40（3）：93-94.
[12] 陈更新，劳绍贤，黄志新，等.中药对脾胃湿热证患者胃粘膜水通道蛋白3、4基因表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2005，25（3）：199-202.
（收稿日期：2014-10-10；编辑：华强）