为建立检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪δ冠状病毒（PDCoV）和猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）的多重荧光定量RT-PCR方法，本研究针对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的M基因、M基因、N基因序列保守区分别设计特异性引物/探针，经各反应条件优化后，建立了检测PEDV、PDCoV、SADS-CoV的多重荧光定量RT-PCR方法。特异性试验结果显示，该方法仅对PEDV、PDCoV、SADS-CoV检测为阳性，对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等的核酸检测均为阴性。敏感性试验结果显示，该方法对PEDV、PDCoV、SADS-CoV重组质粒标准品的检测下限均为1.0×10~1拷贝/μL，且在10~1拷贝/μL～10~6拷贝/μL范围内各重组质粒均与各自的Ct值有良好的线性关系。重复性试验结果显示，批内、批间重复性试验的变异系数均在0.33%～2.53%，重复性和稳定性均较好。利用建立的多重荧光定量RT-PCR方法对采自河南各地的100份临床样品进行检测，并与3种病毒的单一RT-PCR检测方法、相应病毒的标准检测方法（由于SADS-CoV无标准检测方法，则采用RT-PCR扩增后测序并经NCBI BLAST比较分析测序结果）进行比较分析，以评估本实验建立检测方法的临床应用效果。多重荧光定量RT-PCR结果显示，PEDV、PDCoV、SADS-CoV的阳性率分别为38%（38/100）、14%（14/100）、5%（5/100），不存在混合感染现象，与PEDV、PDCoV标准检测方法的符合率为100%，且敏感性高于单一RT-PCR方法。本研究首次建立了一种特异、敏感、快速的多重荧光定量RT-PCR方法，可以用于PEDV、PDCoV、SADS-CoV的鉴别检测，为猪腹泻类疫病鉴别诊断及防控奠定基础。