GII.P16型诺如病毒聚合酶蛋白的原核表达、活性测定和结晶

来源 :国际病毒学杂志 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dayu1215
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目的

原核表达GII.P16型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)蛋白,并对其进行生物活性测定和晶体制备。

方法

首先通过RT-PCR方法获得GII.P16 RdRp完整基因并将其克隆至携带His-Tag PET28a载体,构建重组表达质粒,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并用IPTG诱导RdRp的表达,最后利用SDS-PAGE和Western blot的方法鉴定蛋白的表达情况;采用His-Tag亲和层析和分子筛的方法纯化目的蛋白;分别使用体外酶催化实验和Hampton结晶试剂盒进行蛋白活性测定和晶体筛选。

结果

构建了原核表达重组体PET28a-RdRp,并大量表达了相对分子质量约60 kDa的可溶性蛋白;经两次纯化后,获得了高纯度的目的蛋白,纯度达到90%以上;体外酶催化实验显示RdRp重组蛋白具有良好的生物活性;通过多种生长条件的筛选,获得了优质的RdRp晶体。

结论

本研究成功获得的GII.P16 RdRp蛋白及其晶体,为理解其生物学功能和解析其晶体结构奠定了基础。

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