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摘 要：以猪血为原料，经过血细胞分离、破裂提纯得到血红蛋白，与NaNO2反应制取亚硝基血红蛋白，并采用正交试验法讨论NaNO2添加量、VC添加量、pH值、加热时间对合成试验结果的影响，以OD值评价试验结果。该方法是一种低成本、高效益的方法。结果显示：血红蛋白、NaNO2、VC物质的量比l∶2∶6、pH6.0、加热至60 ℃保持30 min为亚硝基血红蛋白合成试验的最佳工艺条件，可简单而快速的制得亚硝基血红蛋白。
关键词：猪血；血红蛋白；NaNO2；VC；亚硝基血红蛋白
An Optimized Method for Preparing Nitrosohemoglobin from Pig Blood
CHENG Yan1， JIANG Wu-bian1， FU Shao-hui2
（1. Hubei Baodi Agri & Tech （Group） Co. Ltd.， Anlu 432602， China；
2. Tianjin Baodi Agri & Tech （Group） Co. Ltd.， Tianjing 301800， China）
Abstract： Hemoglobin was extracted from the ruptured red blood cells from pigs and then allowed to react with sodium nitrite to form nitrosohemoglobin. The efficiency of nitrosohemoglobin synthesis as evaluated by OD575 nm was investigated with respect to four reaction conditions including the amounts of sodium nitrite and vitamin C， pH and heating time using an orthogonal array design. As a result， a simple， rapid and cost-effective method for preparing nitrosohemoglobin was established by heating a mixture of hemoglobin， sodium nitrite and vitamin C at a molar ratio of l：2：6 adjusted to pH 6.0 to 60 ℃ and maintaining the temperature for 30 minutes.
Key words： pig blood； hemoglobin； sodium nitrite； vitamin C； nitrosohemoglobin
中图分类号：TS201.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）03-0010-04
具有良好色泽的食品，往往能刺激人们的食欲和购买欲，其色泽更是常作为鉴定品质的指标[1]。目前，国内外肉类企业大多采用亚硝酸盐作为肉品的发色剂，来获得理想的色泽和风味，延长保质期[2]。但是，肉制品在热处理加工过程中，亚硝酸盐容易受热形成亚硝胺类的致癌、致畸和致突变物质，从而严重威胁人们的生命健康[3]，故迫切需要一种稳定而安全的亚硝酸盐取代剂。
猪血中蛋白质含量约19%[4]，其主要成分为血红蛋白（hemoglobin，Hb），占全血蛋白总量的2/3[5]。血红蛋白分子由珠蛋白和血红素构成的亚基组成，正常情况下，血红素包被于珠蛋白中；变性后的血红蛋白，血红素暴露出来，与NaNO2在酸性条件下产生的NO-结合，生成红色的亚硝基血红蛋白（nitrosohemoglobin，HbNO）[6-8]。HbNO在一定的条件下分解，缓慢地释放NO-，与肌红蛋白（myoglobin，Mb）结合而呈现鲜艳的红色[9]，起发色作用。HbNO色泽鲜红、对热和氧稳定[10]，相比于NaNO2，它在肉品内自发形成，直接添加避免了NaNO2危害，更有利于食品的安全与健康。本实验从猪血中提取血红蛋白，纯化后与NaNO2作用生成HbNO，并讨论各个因素对提取与合成工艺的影响，以期为实际生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜猪血 湖北宝迪农业科技有限公司；
柠檬酸钠、抗坏血酸、NaOH、NaNO2均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
AR224CN电子天平 奥豪斯仪器有限公司；数显恒温水浴锅 常州荣冠实验分析仪器厂；722-紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；PHS-3E数字式pH计 上海精科实业有限公司；DHG-9070A鼓风干燥箱 上海飞越实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 血红蛋白制备
1.3.1.1 血红蛋白的提取
取新鲜猪血，以全血∶柠檬酸钠为100∶0.5（mL/g）比例，快速加入柠檬酸钠抗凝[11]，用玻璃棒沿一个方向搅拌与猪血充分混匀，低温运回实验室。搅拌5 min后过滤，3 000 r/min离心30 min，弃上层血清；加入质量分数为0.9%生理盐水，搅拌均匀，3 000 r/min离心10 min、弃上清液（重复2 次）[12-13]，收集红血球并记录体积。
分别采用溶胀法[14]、冻融法[15]、超声波法对血细胞进行破壁[16]，并比较3 种方法效果。当溶液由暗红转变为鲜红时，以3 000 r/min离心15 min，用吸管小心吸取上清液，得血红蛋白粗提取液，在显微镜下观察细胞壁破裂情况，以细胞计数法评价比较。 溶胀法：加入红血球细胞与蒸馏水体积比分别为1∶1、1∶1.5、1∶2的混合溶液，电磁搅拌30 min；冻融法：―20 ℃完全冻结后，室温下融化；超声波法：加入红血球细胞与蒸馏水体积比分别为1∶1、1∶1.5、1∶2的混合溶液，超声波处理5 min，功率100 W。
1.3.1.2 血红蛋白纯化
将粗提液中加入适量抗氧化剂VC，并通入N2排除空气，60 ℃水浴30 min，使杂蛋白沉淀，于3 000 r/min离心15 min，吸取上清液。加入10 mg/mL甘油入上清液，后置于4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.1.3 血红蛋白纯度测定
采用碱性羟基高铁血红素法（Alkaline haematind-575，AHD-575）检测血红蛋白纯度。测定原理：在碱性环境下，该试剂中的非离子型表面活性物质会与血红蛋白及其衍生物反应，迅速形成复合物，该复合物稳定且在波长575 nm处有一吸收峰[17]，易观察测定。此法应用的AHD-575稳定、无毒，且对血红蛋白的结果无明显影响。
AHD-575试剂配制：准确称取聚乙二醇辛基苯基醚25.0 g，加入0.1 mol/L NaOH溶液定容至1 L，搅拌均匀，室温保存备用。
标准曲线绘制：配制成不同浓度的猪血红蛋白标准品溶液，分别吸取0.1 mL加入到30 mL AHD-575试剂中，静置反应5 min。以AHD-575试剂为空白，在575 nm波长下，测定吸光度。以标准品的质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制血红蛋白溶液标准曲线，得出回归方程。
样品测定：吸取血红蛋白提取液样品0.1 mL，用标准曲线绘制方法测定其在575 nm处吸光度，带入回归方程计算得血红蛋白含量。
1.3.2 HbNO合成
以纯化后血红蛋白为原料，加入NaNO2、VC，调pH值至酸性，搅拌加热得HbNO溶液[18]，真空冷冻干燥后生成红色粉状物。将合成的亚硝基血红蛋白溶于80%丙酮水溶液中，离心取上清液，用紫外可见分光光度计在450～600 nm下扫描其吸收光谱[19]。
1.3.3 单因素试验
NaNO2、VC量、pH值、加热时间对合成试验都会产生影响，本试验根据严聃等[20]试验设计方案。先讨论NaNO2对合成试验的影响，再取最优NaNO2添加量，依次研究VC添加量、pH值、加热时间对合成试验的影响。
1.3.3.1 NaNO2添加量
以纯化后血红蛋白为原料，pH5、加热时间20 min。测量产物紫外吸光度，固定Hb1 mol、VC添加量4 mol，研究NaNO2添加量为1、2、3 mol对合成试验的影响。
1.3.3.2 VC添加量
调pH5、加热时间20min，固定Hb1mol、NaNO2
2mol，研究VC添加量为4、6、8 mol对合成试验的影响。
1.3.3.3 pH值
在NaNO2∶VC∶Hb物质的量的比2∶6∶1、加热时间20 min的条件下，研究pH值为4.5、5、5.5、6、6.5对合成试验的影响。
1.3.3.4 加热时间
在NaNO2∶VC∶HD物质的量的比2∶6∶1、pH值为5的条件下，研究加热时间为20、25、30、35、40 min对合成试验的影响。
1.3.4 正交试验设计
在单因素试验基础上，对影响HbNO合成效率的NaNO2添加量、VC添加量、pH值、加热时间设计四因素三水平正交试验（表1）。
表 1 HbNO合成正交试验因素水平表
Table 1 Factor and coded levels used in orthogonal array design for the optimization of in nitrosohemoglobin synthesis
水平 因素
A NaNO2添加量/mol B VC添加量/mol C pH D加热时间/min
1 1 4 5 20
2 2 6 5.5 30
3 3 8 6 40
因亚硝基血红蛋白在540 nm处有特征紫外吸收峰，则分别取等体积产物，用540 nm处紫外吸收峰大小即产物量评价上述添加方案。
2 结果与分析
2.1 提取方法的确定
表 2 三种不同方法的破壁效果
Table 2 Comparison of efficiencies of three cell disruption methods
方法 溶胀法（血细胞∶水（V/V）） 冻融法 超声波法（血细胞∶水（V/V））
1∶1 1∶1.5 1∶2 1∶1 1∶1.5 1∶2
破壁率/% 86 96 100 92 82 95 100
如表2所示，采用3 种方法都可以得到很好血红蛋白溶液，其中冻融的方法耗时较长，影响实验进度，首先排除；理论上超声波法的破壁率应高于溶胀法，但蛋白质经超声处理易发生变性沉淀的现象[21]，因此排除；加入血细胞体积2 倍蒸馏水，用溶胀法处理血细胞，可以使血细胞完全溶胀破壁，但增大了提取液的体积，更增加了血红蛋白与空气的接触时间与表面积，使真空浓缩时间加长，使提取效率降低；而当加入蒸馏水体积为1.5 倍时，破壁率即可达96%，故选择此方法。
2.2 血红蛋白纯度的测定
配制一系列质量浓度梯度的猪血红蛋白标准品溶液，以AHD-575法测定吸光度A575，绘得标准曲线为y=0.002 8x+0.006 1（R2=0.9917）。此时吸光度0.2378，血红蛋白质量浓度（C1）=82.75 g/L，蛋白质总质量浓度 （C2）=108.53 g/L，则纯化后血红蛋白纯度得率为：
2.3 紫外光谱扫描结果
图 1 红蛋白水溶液（a）和硝基血红蛋白丙酮提取液（b）紫外扫描图
Fig.1 UV spectra of aqueous hemoglobin solution （a） and nitrosohemoglobin in acetone （b）
紫外可见吸收峰的形状、波峰与波谷位置、吸收峰个数都可以反应该物质的结构。物质不同。分子结构不同，决定了吸收光谱也不同。从图1可看出，血红蛋白液与反应后所得HbNO的吸收曲线明显不同，即吸光度曲线形状、吸收峰处波长均不同，从而证明生成了新物质。
2.4 单因素试验结果
2.4.1 NaNO2添加量
从图2可知，随着加入反应物量的增加，产物量先增加后趋于平衡，在Hb1 mol、VC 4 mol条件下，当NaNO2为2 mol时，产物量基本达最大，NaNO2与Hb完全反应。
图 2 NaNO2添加量对合成试验的影响
Fig.2 Effect of sodium nitrite dosage on nitrosohemoglobin synthesis
2.4.2 VC添加量
图 3 VC添加量对合成试验的影响
Fig.3 Effect of vitamin C dosage on nitrosohemoglobin synthesis
从图3可知，随着加入反应物量的增加，产物量先增加后趋于平衡，在Hb1 mol、NaNO2 2 mol条件下，VC添加量为6 mol时，产物量基本达最大，VC抗氧化效果显著，故选取VC添加量为6 mol。
2.4.3 pH值
图 4 pH值对合成试验的影响
Fig.4 Effect of reaction pH on nitrosohemoglobin synthesis
从图4可知，pH值对合成试验影响十分明显，OD值先增加后趋于平衡，故取pH6.0为最佳反应条件。
2.4.4 加热时间
由图5可知，加热时间对OD值曲线先增加后下降，在30 min处取最大值。合成反应需要一定的时间，但时间过长，产物会接触空气氧化或受热分解，故选择加热时间为30 min。
图 5 加热时间对合成试验的影响
Fig.5 Effect of heating time on nitrosohemoglobin synthesis
2.5 正交试验结果
表 3 合成HbNO正交试验设计及结果
Table 3 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of in nitrosohemoglobin synthesis
试验号 A B C D OD值
1 1 1 1 1 0.388
2 1 2 2 2 0.451
3 1 3 3 3 0.608
4 2 1 2 3 0.755
5 2 2 3 1 0.832
6 2 3 1 2 0.624
7 3 1 3 2 0.786
8 3 2 1 3 0.536
9 3 3 2 1 0.651
K1 1.447 1.929 1.548 1.871
K2 2.211 1.819 1.857 1.861
K3 1.973 1.883 2.226 1.899
k1 0.482 0.643 0.516 0.624
k2 0.737 0.606 0.619 0.620
k3 0.658 0.628 0.742 0.633
R 0.276 0.037 0.226 0.013
由表3可知，9个试验号中A2B2C3D1组合所得产品OD值最高为0.832。从R值可以看出单因素对试验结果影响依次为NaNO2添加量>pH值>VC添加量>加热时间，随着NaNO2添加量、VC添加量、pH值、加热时间的增加，OD值变大，且当Hb∶NaNO2∶VC=1∶2∶6（n/n）时不再增加，比较A2B1C2D3与A3B1C3D2发现2者相差很小，对比pH值的主因素作用，则此水平下加热时间达到30 min后OD值减小，单因素试验中A2B2C3D2的OD值为0.841，大于A2B2C3D1组合所得OD值0.832，故分析正交试验结果最佳组合为A2B2C3D2，此时试验条件为Hb∶NaNO2∶VC物质的量比1∶2∶6、pH 6.0、加热时间30 min。
3 结 论
以猪血为原料，分离得到Hb∶NaNO2∶VC物质的量比1∶2∶6、pH 6.0、加热至60 ℃保持30 min可以简单而快捷的制得HbNO。此方法不断解决了猪血浪费而产生的污染，更提供了一种无污染的食品添加剂制作方法。
参考文献：
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关键词：猪血；血红蛋白；NaNO2；VC；亚硝基血红蛋白
An Optimized Method for Preparing Nitrosohemoglobin from Pig Blood
CHENG Yan1， JIANG Wu-bian1， FU Shao-hui2
（1. Hubei Baodi Agri & Tech （Group） Co. Ltd.， Anlu 432602， China；
2. Tianjin Baodi Agri & Tech （Group） Co. Ltd.， Tianjing 301800， China）
Abstract： Hemoglobin was extracted from the ruptured red blood cells from pigs and then allowed to react with sodium nitrite to form nitrosohemoglobin. The efficiency of nitrosohemoglobin synthesis as evaluated by OD575 nm was investigated with respect to four reaction conditions including the amounts of sodium nitrite and vitamin C， pH and heating time using an orthogonal array design. As a result， a simple， rapid and cost-effective method for preparing nitrosohemoglobin was established by heating a mixture of hemoglobin， sodium nitrite and vitamin C at a molar ratio of l：2：6 adjusted to pH 6.0 to 60 ℃ and maintaining the temperature for 30 minutes.
Key words： pig blood； hemoglobin； sodium nitrite； vitamin C； nitrosohemoglobin
中图分类号：TS201.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）03-0010-04
具有良好色泽的食品，往往能刺激人们的食欲和购买欲，其色泽更是常作为鉴定品质的指标[1]。目前，国内外肉类企业大多采用亚硝酸盐作为肉品的发色剂，来获得理想的色泽和风味，延长保质期[2]。但是，肉制品在热处理加工过程中，亚硝酸盐容易受热形成亚硝胺类的致癌、致畸和致突变物质，从而严重威胁人们的生命健康[3]，故迫切需要一种稳定而安全的亚硝酸盐取代剂。
猪血中蛋白质含量约19%[4]，其主要成分为血红蛋白（hemoglobin，Hb），占全血蛋白总量的2/3[5]。血红蛋白分子由珠蛋白和血红素构成的亚基组成，正常情况下，血红素包被于珠蛋白中；变性后的血红蛋白，血红素暴露出来，与NaNO2在酸性条件下产生的NO-结合，生成红色的亚硝基血红蛋白（nitrosohemoglobin，HbNO）[6-8]。HbNO在一定的条件下分解，缓慢地释放NO-，与肌红蛋白（myoglobin，Mb）结合而呈现鲜艳的红色[9]，起发色作用。HbNO色泽鲜红、对热和氧稳定[10]，相比于NaNO2，它在肉品内自发形成，直接添加避免了NaNO2危害，更有利于食品的安全与健康。本实验从猪血中提取血红蛋白，纯化后与NaNO2作用生成HbNO，并讨论各个因素对提取与合成工艺的影响，以期为实际生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜猪血 湖北宝迪农业科技有限公司；
柠檬酸钠、抗坏血酸、NaOH、NaNO2均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
AR224CN电子天平 奥豪斯仪器有限公司；数显恒温水浴锅 常州荣冠实验分析仪器厂；722-紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；PHS-3E数字式pH计 上海精科实业有限公司；DHG-9070A鼓风干燥箱 上海飞越实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 血红蛋白制备
1.3.1.1 血红蛋白的提取
取新鲜猪血，以全血∶柠檬酸钠为100∶0.5（mL/g）比例，快速加入柠檬酸钠抗凝[11]，用玻璃棒沿一个方向搅拌与猪血充分混匀，低温运回实验室。搅拌5 min后过滤，3 000 r/min离心30 min，弃上层血清；加入质量分数为0.9%生理盐水，搅拌均匀，3 000 r/min离心10 min、弃上清液（重复2 次）[12-13]，收集红血球并记录体积。
分别采用溶胀法[14]、冻融法[15]、超声波法对血细胞进行破壁[16]，并比较3 种方法效果。当溶液由暗红转变为鲜红时，以3 000 r/min离心15 min，用吸管小心吸取上清液，得血红蛋白粗提取液，在显微镜下观察细胞壁破裂情况，以细胞计数法评价比较。 溶胀法：加入红血球细胞与蒸馏水体积比分别为1∶1、1∶1.5、1∶2的混合溶液，电磁搅拌30 min；冻融法：―20 ℃完全冻结后，室温下融化；超声波法：加入红血球细胞与蒸馏水体积比分别为1∶1、1∶1.5、1∶2的混合溶液，超声波处理5 min，功率100 W。
1.3.1.2 血红蛋白纯化
将粗提液中加入适量抗氧化剂VC，并通入N2排除空气，60 ℃水浴30 min，使杂蛋白沉淀，于3 000 r/min离心15 min，吸取上清液。加入10 mg/mL甘油入上清液，后置于4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.1.3 血红蛋白纯度测定
采用碱性羟基高铁血红素法（Alkaline haematind-575，AHD-575）检测血红蛋白纯度。测定原理：在碱性环境下，该试剂中的非离子型表面活性物质会与血红蛋白及其衍生物反应，迅速形成复合物，该复合物稳定且在波长575 nm处有一吸收峰[17]，易观察测定。此法应用的AHD-575稳定、无毒，且对血红蛋白的结果无明显影响。
AHD-575试剂配制：准确称取聚乙二醇辛基苯基醚25.0 g，加入0.1 mol/L NaOH溶液定容至1 L，搅拌均匀，室温保存备用。
标准曲线绘制：配制成不同浓度的猪血红蛋白标准品溶液，分别吸取0.1 mL加入到30 mL AHD-575试剂中，静置反应5 min。以AHD-575试剂为空白，在575 nm波长下，测定吸光度。以标准品的质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制血红蛋白溶液标准曲线，得出回归方程。
样品测定：吸取血红蛋白提取液样品0.1 mL，用标准曲线绘制方法测定其在575 nm处吸光度，带入回归方程计算得血红蛋白含量。
1.3.2 HbNO合成
以纯化后血红蛋白为原料，加入NaNO2、VC，调pH值至酸性，搅拌加热得HbNO溶液[18]，真空冷冻干燥后生成红色粉状物。将合成的亚硝基血红蛋白溶于80%丙酮水溶液中，离心取上清液，用紫外可见分光光度计在450～600 nm下扫描其吸收光谱[19]。
1.3.3 单因素试验
NaNO2、VC量、pH值、加热时间对合成试验都会产生影响，本试验根据严聃等[20]试验设计方案。先讨论NaNO2对合成试验的影响，再取最优NaNO2添加量，依次研究VC添加量、pH值、加热时间对合成试验的影响。
1.3.3.1 NaNO2添加量
以纯化后血红蛋白为原料，pH5、加热时间20 min。测量产物紫外吸光度，固定Hb1 mol、VC添加量4 mol，研究NaNO2添加量为1、2、3 mol对合成试验的影响。
1.3.3.2 VC添加量
调pH5、加热时间20min，固定Hb1mol、NaNO2
2mol，研究VC添加量为4、6、8 mol对合成试验的影响。
1.3.3.3 pH值
在NaNO2∶VC∶Hb物质的量的比2∶6∶1、加热时间20 min的条件下，研究pH值为4.5、5、5.5、6、6.5对合成试验的影响。
1.3.3.4 加热时间
在NaNO2∶VC∶HD物质的量的比2∶6∶1、pH值为5的条件下，研究加热时间为20、25、30、35、40 min对合成试验的影响。
1.3.4 正交试验设计
在单因素试验基础上，对影响HbNO合成效率的NaNO2添加量、VC添加量、pH值、加热时间设计四因素三水平正交试验（表1）。
表 1 HbNO合成正交试验因素水平表
Table 1 Factor and coded levels used in orthogonal array design for the optimization of in nitrosohemoglobin synthesis
水平 因素
A NaNO2添加量/mol B VC添加量/mol C pH D加热时间/min
1 1 4 5 20
2 2 6 5.5 30
3 3 8 6 40
因亚硝基血红蛋白在540 nm处有特征紫外吸收峰，则分别取等体积产物，用540 nm处紫外吸收峰大小即产物量评价上述添加方案。
2 结果与分析
2.1 提取方法的确定
表 2 三种不同方法的破壁效果
Table 2 Comparison of efficiencies of three cell disruption methods
方法 溶胀法（血细胞∶水（V/V）） 冻融法 超声波法（血细胞∶水（V/V））
1∶1 1∶1.5 1∶2 1∶1 1∶1.5 1∶2
破壁率/% 86 96 100 92 82 95 100
如表2所示，采用3 种方法都可以得到很好血红蛋白溶液，其中冻融的方法耗时较长，影响实验进度，首先排除；理论上超声波法的破壁率应高于溶胀法，但蛋白质经超声处理易发生变性沉淀的现象[21]，因此排除；加入血细胞体积2 倍蒸馏水，用溶胀法处理血细胞，可以使血细胞完全溶胀破壁，但增大了提取液的体积，更增加了血红蛋白与空气的接触时间与表面积，使真空浓缩时间加长，使提取效率降低；而当加入蒸馏水体积为1.5 倍时，破壁率即可达96%，故选择此方法。
2.2 血红蛋白纯度的测定
配制一系列质量浓度梯度的猪血红蛋白标准品溶液，以AHD-575法测定吸光度A575，绘得标准曲线为y=0.002 8x+0.006 1（R2=0.9917）。此时吸光度0.2378，血红蛋白质量浓度（C1）=82.75 g/L，蛋白质总质量浓度 （C2）=108.53 g/L，则纯化后血红蛋白纯度得率为：
2.3 紫外光谱扫描结果
图 1 红蛋白水溶液（a）和硝基血红蛋白丙酮提取液（b）紫外扫描图
Fig.1 UV spectra of aqueous hemoglobin solution （a） and nitrosohemoglobin in acetone （b）
紫外可见吸收峰的形状、波峰与波谷位置、吸收峰个数都可以反应该物质的结构。物质不同。分子结构不同，决定了吸收光谱也不同。从图1可看出，血红蛋白液与反应后所得HbNO的吸收曲线明显不同，即吸光度曲线形状、吸收峰处波长均不同，从而证明生成了新物质。
2.4 单因素试验结果
2.4.1 NaNO2添加量
从图2可知，随着加入反应物量的增加，产物量先增加后趋于平衡，在Hb1 mol、VC 4 mol条件下，当NaNO2为2 mol时，产物量基本达最大，NaNO2与Hb完全反应。
图 2 NaNO2添加量对合成试验的影响
Fig.2 Effect of sodium nitrite dosage on nitrosohemoglobin synthesis
2.4.2 VC添加量
图 3 VC添加量对合成试验的影响
Fig.3 Effect of vitamin C dosage on nitrosohemoglobin synthesis
从图3可知，随着加入反应物量的增加，产物量先增加后趋于平衡，在Hb1 mol、NaNO2 2 mol条件下，VC添加量为6 mol时，产物量基本达最大，VC抗氧化效果显著，故选取VC添加量为6 mol。
2.4.3 pH值
图 4 pH值对合成试验的影响
Fig.4 Effect of reaction pH on nitrosohemoglobin synthesis
从图4可知，pH值对合成试验影响十分明显，OD值先增加后趋于平衡，故取pH6.0为最佳反应条件。
2.4.4 加热时间
由图5可知，加热时间对OD值曲线先增加后下降，在30 min处取最大值。合成反应需要一定的时间，但时间过长，产物会接触空气氧化或受热分解，故选择加热时间为30 min。
图 5 加热时间对合成试验的影响
Fig.5 Effect of heating time on nitrosohemoglobin synthesis
2.5 正交试验结果
表 3 合成HbNO正交试验设计及结果
Table 3 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of in nitrosohemoglobin synthesis
试验号 A B C D OD值
1 1 1 1 1 0.388
2 1 2 2 2 0.451
3 1 3 3 3 0.608
4 2 1 2 3 0.755
5 2 2 3 1 0.832
6 2 3 1 2 0.624
7 3 1 3 2 0.786
8 3 2 1 3 0.536
9 3 3 2 1 0.651
K1 1.447 1.929 1.548 1.871
K2 2.211 1.819 1.857 1.861
K3 1.973 1.883 2.226 1.899
k1 0.482 0.643 0.516 0.624
k2 0.737 0.606 0.619 0.620
k3 0.658 0.628 0.742 0.633
R 0.276 0.037 0.226 0.013
由表3可知，9个试验号中A2B2C3D1组合所得产品OD值最高为0.832。从R值可以看出单因素对试验结果影响依次为NaNO2添加量>pH值>VC添加量>加热时间，随着NaNO2添加量、VC添加量、pH值、加热时间的增加，OD值变大，且当Hb∶NaNO2∶VC=1∶2∶6（n/n）时不再增加，比较A2B1C2D3与A3B1C3D2发现2者相差很小，对比pH值的主因素作用，则此水平下加热时间达到30 min后OD值减小，单因素试验中A2B2C3D2的OD值为0.841，大于A2B2C3D1组合所得OD值0.832，故分析正交试验结果最佳组合为A2B2C3D2，此时试验条件为Hb∶NaNO2∶VC物质的量比1∶2∶6、pH 6.0、加热时间30 min。
3 结 论
以猪血为原料，分离得到Hb∶NaNO2∶VC物质的量比1∶2∶6、pH 6.0、加热至60 ℃保持30 min可以简单而快捷的制得HbNO。此方法不断解决了猪血浪费而产生的污染，更提供了一种无污染的食品添加剂制作方法。
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