论文部分内容阅读
摘 要：為筛选出对烟草甲2龄幼虫具有较好防治效果的病原真菌，在实验室条件下，采用浸渍法测定5株蜡蚧轮枝菌和5株球孢白僵菌对烟草甲2龄幼虫的毒力，筛选出2株对烟草甲2龄幼虫具有高毒力的白僵菌菌株Bb05和Bbr81，将2株菌株配置成不同浓度的孢子悬浮液，测定其毒力并对Bb05菌株的侵染过程进行观察。结果表明，接种孢子浓度1.0×108 mL-1条件下，菌株Bb05处理烟草甲的累积死亡率最高，达77.78%，LT50为8.18 d;菌株Bbr81处理烟草甲的累积死亡率为74.44%，LT50为7.60 d。用不同浓度孢子悬浮液处理烟草甲2龄幼虫后，其累积死亡率随孢子浓度和接种时间的增加而增加，Bb05菌株的LC50为8.3×107 mL-1，菌株Bbr81的LC50为1.2×107 mL-1。筛选所得的2个菌株对烟草甲虫2龄幼虫的毒力较高，具有一定的开发应用潜力。
关键词：昆虫病原真菌;烟草甲;生物测定;生物防治
Screening for Highly Virulent Entomopathogenic Fungi Against Lasioderma serricorne （Fabricius） Larvae
QI Yuzhe1， YAN Fangfang2， LI Chengjun3， LIU Su1， CHEN Peng4， XU Chuantao5，
LI Maoye1*， LIU Mingke1， YAN Xueli1， LI Bin4*
（1. Key Laboratory of Biology and Sustainable Management of Plant Diseases and Pests of Anhui Higher Education Institutes， School of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China; 2. Sichuan Panzhihua Branch Tobacco Company， Panzhihua， Sichuan 617026， China; 3. Tobacco Research Institute of Henan Academy of Agricultural Sciences， Xuchang， Henan 464000， China; 4. Sichuan Branch of China National Tobacco Corporation， Chengdu 630041， China; 5. Luzhou Company of Sichuan Tobacco Company， Luzhou， Sichuan 646600， China）
Abstract： In order to screen for entomopathogenic fungi with better control effect on the second instar larvae of Lasioderma serricorne， in this experiment， 5 strains of Verticillium lecanii and 5 strains of Beauveria bassiana were determined by the impregnation method. Two Beauveria bassiana strains Bb05 and Bbr81 with high virulence to the second instar larvae of Lasioderma serricorne were obtained， and the two strains were prepared into different concentrations of spore suspension， and their virulence was determined. The infection process of the Bb05 strain was observed. The results showed that， at the concentration of 1.0×108 mL-1， Bb05 had the highest cumulative death rate to L. serricorne （77.78%） and LT50 （8.18 d）. The cumulative mortality of strain Bbr81 and LT50 was 74.44% and 7.60 d respectively. After treating the Lasioderma serricorne with different concentrations of spore suspensions， the cumulative mortality increased with the increase of spore concentration and inoculation time. The LC50 of strain BB05 was 8.3×107 spores mL-1， and that of strain Bbr81 was 1.2×107 spores mL-1. The two strains were highly virulent to the 2nd instar larvae of tobacco beetle， and have a certain potential for development and application.
Keywords： entomopathogenic fungi; Lasioderma serricorne; bioassay; biological control 烟草甲[Lasioderma serricorne （Fabricius）]又名烟草窃蠹，属鞘翅目（Coleoptera），窃蠹科（Anobiidae），具有适应能力强、食性广泛、产卵量大等特点，危害和污染各个加工阶段的烟草产品。此虫特别喜欢蛀食醇化1～2年的烟草叶片，其幼虫常隐匿于烟叶的夹层褶皱中取食烟叶，造成烟叶穿孔破碎，同时其虫尸及虫粪污染烟叶，严重影响烟叶品质[1-2]。目前对烟草甲的防治主要依靠磷化氢熏蒸，但随着烟草甲对磷化氢的抗性逐渐增强，其熏蒸效果大幅度降低[3-6]。同时，化学熏蒸极易造成环境污染，因此，迫切需要寻找对环境友好且不易产生抗性的防治药剂，以替代化学熏蒸。
昆虫病原真菌具有不污染环境、可持续控制害虫、易工业化生产等特点，在农林业害虫防治中具有巨大的应用价值。近年来，国内外的许多学者对其进行了广泛深入研究[7]。目前，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）、蜡蚧轮枝菌（Verticilliu mfungus）等具有广谱杀虫作用的昆虫病原真菌已经在国内外商品化，并在重要农林害虫防治中取得了较为明显的效果。但国内外有关昆虫病原真菌防治烟草甲的研究报道较少。
因此，本研究选择保存于安徽农业大学植物保护学院生物防治实验室的5株蜡蚧轮枝菌菌株和5株球孢白僵菌菌株，以烟草甲2龄幼虫作为供试昆虫，通过室内测定比较各个菌株之间的毒力差异，同时对比不同浓度各菌株对烟草甲2龄幼虫的致死率，将累积校正死亡率大于70%的两株菌株进行时间-剂量-死亡率关系分析，进一步验证昆虫病原真菌菌株对烟草甲2龄幼虫的致病性，并利用体式显微镜观察了1株高毒力菌株侵染烟草甲2龄幼虫的过程，以期为烟草甲的生物防治研究提供理论和技术依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
SDAY培养基：葡萄糖40 g，酵母浸出粉10 g，琼脂20 g，蛋白胨10 g。水1000 mL，121 ℃灭菌15 min备用。0.05%吐温-80溶液，121 ℃灭菌备用。
1.2 供试仪器
人工气候箱（上海一恒科学仪器有限公司），体式显微镜（Nikon公司SMZ1500型），光学显微镜（leica microscope DM500型），血球计数板（上海求精生化有限公司）。
1.3 供试昆虫
供试烟草甲于2018年采自四川省烟草公司泸州市公司烟叶仓储中心库，在安徽农业大学植物保护学院昆虫饲养室内使用小麦粉与酵母粉（重量比20∶1，均匀混合）进行饲养。饲养温度（26±2）℃，光周期为光照14 h∶黑暗10 h[8-10]。挑选体型相近、生命力强的烟草甲2龄幼虫进行试验。
1.4 供试菌株
5株蜡蚧轮枝菌和5株球孢白僵菌系从田间采集的僵虫上分离纯化获得，供试菌株皆保存于安徽农业大学植物保护学院生物防治实验室。各菌株的编号、寄主及采集地见表1。
1.5 菌落培养及形态观察
将活化的菌株用孢子液点植法接种于9 cm的SDAY培养基平板上，取供试真菌的分生孢子液3 μL点植在培养皿表面中心，使接种面呈均匀的圆形，每株菌株接种3个培养皿。接菌后保藏于（25±1）℃、RH（85±5）%、光周期为光照16 h∶黑暗8 h的光照培养箱中进行培养。记录菌落形态、颜色及分生孢子粉色泽。
菌落生长速率采用十字交叉法，于接种3 d后开始测量。菌株生长15 d后用边长为1 cm的正方形打孔器分别在菌落中心和菌落边缘取菌块5个，放入10 mL含有0.05% Tween-80无菌水的试管中，在涡旋混合器上振蕩10 min，用血球计数板测定孢子含量。
1.6 烟草甲幼虫高毒力菌株筛选
将活化后的10个菌株的菌丝及分生孢子分别刮取至含有0.05%吐温-80的无菌水溶液中，使用涡旋振荡器振荡5 min，用滤纸去除多余菌丝，将孢子悬浮液用血球计数板计数后，稀释至1.0×108 mL-1备用[11]。
将生长发育良好，活力强的烟草甲2龄幼虫30头作为1组，共6组。其中3组为试验组，采用浸渍法进行真菌接种，将幼虫在各个菌悬液中浸渍10 s，取出后在滤纸上去除多余菌液;其余3组为对照组，采用0.05%吐温-80溶液进行浸渍处理。处理后的幼虫均移至盛有饲料的培养皿，在（26±2） ℃，相对湿度（80±5）%条件下饲养，连续观察10 d，记录试虫死亡数，每个处理重复3次。
1.7 不同孢子浓度悬浮液对烟草甲幼虫的毒力测定
经试验筛选获得2株对烟草甲致死率大于70%的菌株（Bb05和Bbr81），将其分别配制成4个浓度（1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108 mL-1）的孢子悬浮液[12]，使用1.6中的方法接种烟草甲幼虫，以0.05%吐温-80作为对照，每组30头，重复3次，处理方式及饲养方法同1.6。
1.8 白僵菌对烟草甲幼虫的侵染过程观察
将筛选出的Bb05菌株以1.0×108 mL-1的孢子悬浮液用浸渍法（同1.6）侵染烟草甲2龄幼虫，每隔24 h用体式显微镜进行观察，并记录烟草甲体表形态变化。
1.9 数据处理
使用DPS软件[13]对试验数据进行统计分析，计算出LT50和LC50，用Duncan新复极差法进行多重比较[14-15]。
2 结 果
2.1 供试菌株的菌落形态和培养性状
供试的昆虫病原真菌在SDAY培养基中的菌落形态皆为近圆形毛毡状（图1、表2），10株真菌菌落表面皆具有同心轮纹，但同心轮纹的形状各不相同，其中菌株LJ1、Bb05、Bbr81中间较厚略凸起外缘较薄;放射状脊沟纹明显，有多道明显的环状脊沟纹。LJ4、LJ5、LJ7、Bb01、Bb08、Bbr81、Bbr84等7个菌株的菌落颜色及孢子粉颜色多为乳白色，而LJ1、LJ10、Bb05的菌落及孢子为白色，其中菌株Bb05和菌株Bbr81具有明显分生孢子层，而其他菌株大多菌丝明显，说明菌株Bb05和菌株Bbr81具有产孢量大的特点。 由表3可以看出，供試真菌菌株在SDAY培养基上的菌落直径（5 d，F9，20=51.54，p<0.0001;10 d， F9，20=53.22，p<0.0001;15 d，F9，20=58.28，p<0.0001）、产孢量（F9，20=9.16，p<0.0001）存在显著性差异。其中Bb05和Bbr81菌株的菌落生长最快，培养15 d时其菌落直径分别为50.37和49.10 mm。Bbr81的产孢量最高，为7.13×107 cm-2，其次是Bb05菌株，产孢量达6.98×107 cm-2，与Bbr81的产孢量没有显著差异。
2.2 不同昆虫病原真菌菌株对烟草甲幼虫的毒力
由表4看出，10种昆虫病原真菌对烟草甲幼虫都具有一定的致病性，不同的昆虫病原真菌对烟草甲幼虫的累积死亡率存在差异（F9，30=26.82，p<0.0001），菌株Bb05的校正死亡率最高，累积死亡率达到77.78%，LT50为8.18 d。其次，菌株Bbr81的累积死亡率为74.44%，LT50为7.60 d。其他菌株的校正死亡率显著低于菌株Bb05和菌株Bbr81，表明这两种菌株对烟草甲幼虫具有较高的毒力。
2.3 不同浓度昆虫病原真菌孢子悬浮液对烟草甲2龄幼虫的毒力及侵染过程
图2示出，高浓度的白僵菌孢子悬浮液比低浓度更早更有效地致使烟草甲2龄幼虫死亡;同时，随着接种时间的推移，烟草甲2龄幼虫的累积死亡率逐步增加。在孢子浓度为1.0×108 mL-1条件下接种10 d，菌株Bbr81对烟草甲2龄幼虫的致死率达到74.44%，菌株Bb05的致死率达77.78%。
由表5可见，以接菌9 d后的致死率计算，菌株Bb05对烟草甲2龄幼虫的致死中浓度LC50孢子浓度为1.2×107 mL-1，菌株Bbr81的LC50为8.3×107 mL-1，经过比较菌株Bb05对烟草甲幼2龄幼虫的毒力大于菌株Bbr81。
由图3可见，使用孢子浓度为1.0×108 mL-1的菌株Bb05浸渍接种，烟草甲2龄幼虫于接种3～4 d开始出现活力减弱现象，虫体颜色逐渐变暗，少数幼虫头部和足部出现白色菌丝，开始出现死亡现象，5～6 d后虫体整个变为紫色，体型稍微减小，柔软虫体变僵，菌丝逐渐伸出虫体，并将虫体整个包裹住，随着时间的延长虫体可见大量分生孢子。
3 讨 论
本研究对从田间采集的僵虫进行分离纯化，获得5株白僵菌和5株轮枝菌，并对它们进行生物学性状和致病力研究，发现不同菌株之间的生物学特性存在显著差异，进一步证实了不同菌株对烟草甲的致病力与其生长速率、产孢量、孢子萌发率等生物学性状相关，其中菌株生长速率快、产孢量高、孢子萌发速率高的菌株对烟草甲的毒力更强。这与前人[16-19]的研究结果基本一致。张龙娃等[20]采用不同浓度白僵菌孢子悬浮液对美国白蛾进行毒力试验，发现随孢子浓度升高，真菌对美国白蛾的侵染率呈上升趋势。这与本研究发现的高浓度白僵菌孢子悬浮液对烟草甲2龄幼虫具有更高的致死率基本一致。本研究还发现白僵菌菌株Bb05、Bbr81对烟草甲2龄幼虫具有较高的毒力，这与张晓敏等[12]的报道一致。其中，Bb05菌株在培养15 d时生长最快（直径50.37 mm）、产孢量最高（6.98×107 cm-2），在孢子浓度为108 mL-1时接种对烟草甲2龄幼虫的LT50最短（8.19 d），致病力最强（接种10 d校正死亡率77.78%）。依据接种9 d的结果，Bb05菌株对烟草甲2龄幼虫的LC50为1.2×107 mL-1，较Bbr81更低。
致病力的强弱是评定真菌防治价值的重要标准之一。轮枝菌也是一种广谱高效、应用效果较好的昆虫病原真菌，目前主要用于蚧类、螨类、蚜虫类和粉虱类的绿色防控[19]。但本研究选用的5株轮枝菌菌株对烟草甲2龄幼虫的致病力明显低于白僵菌菌株。初步推测，虽然两种真菌的致病机理相似，但不同菌株在孢子萌发过程中所产生的蛋白酶、脂肪酶以及几丁质酶存在差异[20]，从而导致白僵菌菌株与蜡蚧菌菌株对烟草甲的致病力存在较为明显的差别。
4 结 论
本研究发现白僵菌菌株Bb05、Bbr81对烟草甲2龄幼虫具有较好防治效果，其中Bb05在产孢量、菌落生长速度和毒力等方面更优，可为后续烟草甲雄性成虫携菌侵染雌雄成虫的实仓防治提供理论基础。而在实际应用中适宜真菌萌发的温湿度、药剂剂型、实仓防治以及真菌保存方法等，还需进一步验证。
参考文献
[1] 吴彦，尤春雪，田兆福，等. 牡荆叶挥发油对烟草甲的杀虫活性[J]. 植物保护，2016，42（5）：97-102，109.
WU Y， YOU C X， TIAN Z F， et al. Insecticidal activity of volatile oil from chastetree leaves on tobacco-a[J]. Plant Protection， 2016， 42（5）： 97-102， 109.
[2] EDDE P A. Biology， ecology， and control of Lasioderma serricorne （F.） （Coleoptera： Anobiidae）： a review[J]. Journal of Economic Entomology， 2019， 112（3）： 1011-1031.
[3] MASATOSHI H， KASAISHI Y， HORI M， et al. Effects of the conditions of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Fabricius） （Coleoptera： Anobiidae）， on the knockdown time by phosphine fumigation[J]. Japanese Journal of Applied Entomology and Zoology， 2006， 50（1）： 13-17. [4] HORI M， KASAISHI Y. Estimation of the phosphine resistance level of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Fabricius） （Coleoptera： Anobiidae）， by the knockdown time of adult[J]. Applied Entomology and Zoology， 2005， 40（4）： 557-561.
[5] IMAI T， HARADA H. Low-temperature as an alternative to fumigation to disinfest stored tobacco of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （F.） （Coleoptera： Anobiidae）[J]. Applied Entomology and Zoology， 2006， 41（1）： 87-91.
[6] SAGLAM O， EDDE P A， PHILLIPS T W. Resistance of Lasioderma serricorne （Coleoptera： Anobiidae） to fumigation with phosphine[J]. Journal of Econmic Entomology， 2015， 108（5）： 2489-2495.
[7] 蒲蛰龙，李增智. 昆虫真菌学[M]. 合肥：安徽科学技术出版社，1996.
PU Z L， LI Z Z. Insect mycology[M]. Hefei： Anhui Publishing House of Science and Technology， 1996.
[8] SHINODA K; FUJISAKI K. Effect of adult feeding on longevity and fecundity of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne F. （Coleoptera ： Anobiidae）[J]. Applied Entomology and Zoology， 2001， 36（2）： 219-223.
[9] 楊绍佳，邱雯雯，史梦竹，等. 不同湿度下烟草甲实验种群两性生命表的构建[J]. 福建农业学报，2018，33（2）：177-185.
YANG S J， QIU W W， SHI M Z， et al. Construction of gender life table in tobacco a experimental population under different humidity[J]. Journal of Fujian Agriculture， 2018， 33（2）： 177-185.
[10] 郭军，戴仁怀，杨洪，等. 烟草甲的优良寄生蜂象虫金小蜂的生物学特性[J]. 中国生物防治学报，2018，34（5）：649-655.
GUO J， DAI R H， YANG H， et al. Biological characteristics of Anisopteromalus calandrae （Howard） （Hymenoptera： Pteromalidae： Anisopteromalus）， parasitized on Lasioderma serricorne （Fabricius）[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2018， 34（5）： 649-655.
[11] 张艳梅，谢映平，薛皎亮，等. 油松毛虫受球孢白僵菌感染的组织病理学变化[J]. 昆虫学报，2011，54（5）：531-539.
ZHANG Y M， XIE Y P， XUE J L， et al. Histopathological changes in Dendrolimus tabulaeformis （Lepidoptera：Lasiocampidae） infected by Beauveria bassiana[J]. Acta Entomologica Sinica， 2011， 54（5）： 531-539.
[12] 张晓敏，杨辉，施鸣，等. 防治烟草甲白僵菌的仓储应用菌株选育[J]. 中国烟草学报，2015，21（2）：79-84.
ZHANG X M， YANG H， SHI M， et al. Screening and breeding of Beauveria bassiana for controlling tobacco beetles[J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 21（2）： 79-84.
[13] 唐启义，冯明光. 实用统计分析及其DPS数据处理系统[M]. 北京：科学出版社，2002.
TANG Q Y， FENG M G. DPS data processing system for practical statistics[M]. Beijing： Science Press， 2002.
[14] TSUCHIYA S， KASAISHI Y， HARADA H， et al. Assessment of the efficacy of Japanese Bacillus thuringiensis isolates against the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Coleoptera ： Anobiidae）[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2002， 81（2）： 122-126. [15] HORI M， MIWA M， LIZAWA H. Host suitability of various stored food products for the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Coleoptera： Anobiidae）[J]. Applied Entomology and Zoology， 2011， 46（4）： 463-469.
[16] 孟祥坤，朱超，于新，等. 高毒力白僵菌的筛选及对花生甜菜夜蛾的致病力[J]. 中国生物防治学报，2018，34（2）：259-265.
MENG X K， ZHU C， YU X， et al. Screening of highly toxic Beauveria bassiana and its pathogenicity against peanut beet night moth[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2008， 34（2）： 259-265.
[17] 雷妍圓，吕利华，何余容，等. 球孢白僵菌生物学特性与其对小菜蛾致病力相关性分析[J]. 中国生物防治，2010，26（2）：143-148.
LEI Y Y， LYU L H， HE Y R， et al. Correlation between biological characteristics of Beauveria bassiana and its virulence to plutella xylostella[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2010， 26（2）： 143-148.
[18] 胡本进，徐丽娜，胡飞，等. 稻蛀茎夜蛾高致病性球孢白僵菌菌株筛选[J]. 中国生物防治学报，2015，31（2）：280-283.
HU B J， XU L N， HU F， et al. Screening of highly pathogenic strains of Beauveria bassiana against Sesamia inferens[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2015， 31（2）： 280-283.
[19] 蔡春霞，李茂业，陈德鑫，等. 八株蜡蚧轮枝菌的生物学特性及其对烟蚜致病性的影响[J]. 中国烟草科学，2018，39（5）：86-93.
CAI C X， LI M Y， CHEN D X， et al. Biological characteristics of eight Verticillium lecanii and their effects on the pathogenicity against Myzus persicae aphids[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（5）： 86-93.
[20] 杨晓昱，于蓉蓉. 蜡蚧轮枝菌防治植物病虫害研究进展[J]. 中国植保导刊，2005（5）：9-11.
YANG X Y， YU R R. Review on research progress on the control of crop pests by using Verticillium lecanii[J]. China Plant Protection， 2005（5）： 9-11.
关键词：昆虫病原真菌;烟草甲;生物测定;生物防治
Screening for Highly Virulent Entomopathogenic Fungi Against Lasioderma serricorne （Fabricius） Larvae
QI Yuzhe1， YAN Fangfang2， LI Chengjun3， LIU Su1， CHEN Peng4， XU Chuantao5，
LI Maoye1*， LIU Mingke1， YAN Xueli1， LI Bin4*
（1. Key Laboratory of Biology and Sustainable Management of Plant Diseases and Pests of Anhui Higher Education Institutes， School of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China; 2. Sichuan Panzhihua Branch Tobacco Company， Panzhihua， Sichuan 617026， China; 3. Tobacco Research Institute of Henan Academy of Agricultural Sciences， Xuchang， Henan 464000， China; 4. Sichuan Branch of China National Tobacco Corporation， Chengdu 630041， China; 5. Luzhou Company of Sichuan Tobacco Company， Luzhou， Sichuan 646600， China）
Abstract： In order to screen for entomopathogenic fungi with better control effect on the second instar larvae of Lasioderma serricorne， in this experiment， 5 strains of Verticillium lecanii and 5 strains of Beauveria bassiana were determined by the impregnation method. Two Beauveria bassiana strains Bb05 and Bbr81 with high virulence to the second instar larvae of Lasioderma serricorne were obtained， and the two strains were prepared into different concentrations of spore suspension， and their virulence was determined. The infection process of the Bb05 strain was observed. The results showed that， at the concentration of 1.0×108 mL-1， Bb05 had the highest cumulative death rate to L. serricorne （77.78%） and LT50 （8.18 d）. The cumulative mortality of strain Bbr81 and LT50 was 74.44% and 7.60 d respectively. After treating the Lasioderma serricorne with different concentrations of spore suspensions， the cumulative mortality increased with the increase of spore concentration and inoculation time. The LC50 of strain BB05 was 8.3×107 spores mL-1， and that of strain Bbr81 was 1.2×107 spores mL-1. The two strains were highly virulent to the 2nd instar larvae of tobacco beetle， and have a certain potential for development and application.
Keywords： entomopathogenic fungi; Lasioderma serricorne; bioassay; biological control 烟草甲[Lasioderma serricorne （Fabricius）]又名烟草窃蠹，属鞘翅目（Coleoptera），窃蠹科（Anobiidae），具有适应能力强、食性广泛、产卵量大等特点，危害和污染各个加工阶段的烟草产品。此虫特别喜欢蛀食醇化1～2年的烟草叶片，其幼虫常隐匿于烟叶的夹层褶皱中取食烟叶，造成烟叶穿孔破碎，同时其虫尸及虫粪污染烟叶，严重影响烟叶品质[1-2]。目前对烟草甲的防治主要依靠磷化氢熏蒸，但随着烟草甲对磷化氢的抗性逐渐增强，其熏蒸效果大幅度降低[3-6]。同时，化学熏蒸极易造成环境污染，因此，迫切需要寻找对环境友好且不易产生抗性的防治药剂，以替代化学熏蒸。
昆虫病原真菌具有不污染环境、可持续控制害虫、易工业化生产等特点，在农林业害虫防治中具有巨大的应用价值。近年来，国内外的许多学者对其进行了广泛深入研究[7]。目前，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）、蜡蚧轮枝菌（Verticilliu mfungus）等具有广谱杀虫作用的昆虫病原真菌已经在国内外商品化，并在重要农林害虫防治中取得了较为明显的效果。但国内外有关昆虫病原真菌防治烟草甲的研究报道较少。
因此，本研究选择保存于安徽农业大学植物保护学院生物防治实验室的5株蜡蚧轮枝菌菌株和5株球孢白僵菌菌株，以烟草甲2龄幼虫作为供试昆虫，通过室内测定比较各个菌株之间的毒力差异，同时对比不同浓度各菌株对烟草甲2龄幼虫的致死率，将累积校正死亡率大于70%的两株菌株进行时间-剂量-死亡率关系分析，进一步验证昆虫病原真菌菌株对烟草甲2龄幼虫的致病性，并利用体式显微镜观察了1株高毒力菌株侵染烟草甲2龄幼虫的过程，以期为烟草甲的生物防治研究提供理论和技术依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
SDAY培养基：葡萄糖40 g，酵母浸出粉10 g，琼脂20 g，蛋白胨10 g。水1000 mL，121 ℃灭菌15 min备用。0.05%吐温-80溶液，121 ℃灭菌备用。
1.2 供试仪器
人工气候箱（上海一恒科学仪器有限公司），体式显微镜（Nikon公司SMZ1500型），光学显微镜（leica microscope DM500型），血球计数板（上海求精生化有限公司）。
1.3 供试昆虫
供试烟草甲于2018年采自四川省烟草公司泸州市公司烟叶仓储中心库，在安徽农业大学植物保护学院昆虫饲养室内使用小麦粉与酵母粉（重量比20∶1，均匀混合）进行饲养。饲养温度（26±2）℃，光周期为光照14 h∶黑暗10 h[8-10]。挑选体型相近、生命力强的烟草甲2龄幼虫进行试验。
1.4 供试菌株
5株蜡蚧轮枝菌和5株球孢白僵菌系从田间采集的僵虫上分离纯化获得，供试菌株皆保存于安徽农业大学植物保护学院生物防治实验室。各菌株的编号、寄主及采集地见表1。
1.5 菌落培养及形态观察
将活化的菌株用孢子液点植法接种于9 cm的SDAY培养基平板上，取供试真菌的分生孢子液3 μL点植在培养皿表面中心，使接种面呈均匀的圆形，每株菌株接种3个培养皿。接菌后保藏于（25±1）℃、RH（85±5）%、光周期为光照16 h∶黑暗8 h的光照培养箱中进行培养。记录菌落形态、颜色及分生孢子粉色泽。
菌落生长速率采用十字交叉法，于接种3 d后开始测量。菌株生长15 d后用边长为1 cm的正方形打孔器分别在菌落中心和菌落边缘取菌块5个，放入10 mL含有0.05% Tween-80无菌水的试管中，在涡旋混合器上振蕩10 min，用血球计数板测定孢子含量。
1.6 烟草甲幼虫高毒力菌株筛选
将活化后的10个菌株的菌丝及分生孢子分别刮取至含有0.05%吐温-80的无菌水溶液中，使用涡旋振荡器振荡5 min，用滤纸去除多余菌丝，将孢子悬浮液用血球计数板计数后，稀释至1.0×108 mL-1备用[11]。
将生长发育良好，活力强的烟草甲2龄幼虫30头作为1组，共6组。其中3组为试验组，采用浸渍法进行真菌接种，将幼虫在各个菌悬液中浸渍10 s，取出后在滤纸上去除多余菌液;其余3组为对照组，采用0.05%吐温-80溶液进行浸渍处理。处理后的幼虫均移至盛有饲料的培养皿，在（26±2） ℃，相对湿度（80±5）%条件下饲养，连续观察10 d，记录试虫死亡数，每个处理重复3次。
1.7 不同孢子浓度悬浮液对烟草甲幼虫的毒力测定
经试验筛选获得2株对烟草甲致死率大于70%的菌株（Bb05和Bbr81），将其分别配制成4个浓度（1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108 mL-1）的孢子悬浮液[12]，使用1.6中的方法接种烟草甲幼虫，以0.05%吐温-80作为对照，每组30头，重复3次，处理方式及饲养方法同1.6。
1.8 白僵菌对烟草甲幼虫的侵染过程观察
将筛选出的Bb05菌株以1.0×108 mL-1的孢子悬浮液用浸渍法（同1.6）侵染烟草甲2龄幼虫，每隔24 h用体式显微镜进行观察，并记录烟草甲体表形态变化。
1.9 数据处理
使用DPS软件[13]对试验数据进行统计分析，计算出LT50和LC50，用Duncan新复极差法进行多重比较[14-15]。
2 结 果
2.1 供试菌株的菌落形态和培养性状
供试的昆虫病原真菌在SDAY培养基中的菌落形态皆为近圆形毛毡状（图1、表2），10株真菌菌落表面皆具有同心轮纹，但同心轮纹的形状各不相同，其中菌株LJ1、Bb05、Bbr81中间较厚略凸起外缘较薄;放射状脊沟纹明显，有多道明显的环状脊沟纹。LJ4、LJ5、LJ7、Bb01、Bb08、Bbr81、Bbr84等7个菌株的菌落颜色及孢子粉颜色多为乳白色，而LJ1、LJ10、Bb05的菌落及孢子为白色，其中菌株Bb05和菌株Bbr81具有明显分生孢子层，而其他菌株大多菌丝明显，说明菌株Bb05和菌株Bbr81具有产孢量大的特点。 由表3可以看出，供試真菌菌株在SDAY培养基上的菌落直径（5 d，F9，20=51.54，p<0.0001;10 d， F9，20=53.22，p<0.0001;15 d，F9，20=58.28，p<0.0001）、产孢量（F9，20=9.16，p<0.0001）存在显著性差异。其中Bb05和Bbr81菌株的菌落生长最快，培养15 d时其菌落直径分别为50.37和49.10 mm。Bbr81的产孢量最高，为7.13×107 cm-2，其次是Bb05菌株，产孢量达6.98×107 cm-2，与Bbr81的产孢量没有显著差异。
2.2 不同昆虫病原真菌菌株对烟草甲幼虫的毒力
由表4看出，10种昆虫病原真菌对烟草甲幼虫都具有一定的致病性，不同的昆虫病原真菌对烟草甲幼虫的累积死亡率存在差异（F9，30=26.82，p<0.0001），菌株Bb05的校正死亡率最高，累积死亡率达到77.78%，LT50为8.18 d。其次，菌株Bbr81的累积死亡率为74.44%，LT50为7.60 d。其他菌株的校正死亡率显著低于菌株Bb05和菌株Bbr81，表明这两种菌株对烟草甲幼虫具有较高的毒力。
2.3 不同浓度昆虫病原真菌孢子悬浮液对烟草甲2龄幼虫的毒力及侵染过程
图2示出，高浓度的白僵菌孢子悬浮液比低浓度更早更有效地致使烟草甲2龄幼虫死亡;同时，随着接种时间的推移，烟草甲2龄幼虫的累积死亡率逐步增加。在孢子浓度为1.0×108 mL-1条件下接种10 d，菌株Bbr81对烟草甲2龄幼虫的致死率达到74.44%，菌株Bb05的致死率达77.78%。
由表5可见，以接菌9 d后的致死率计算，菌株Bb05对烟草甲2龄幼虫的致死中浓度LC50孢子浓度为1.2×107 mL-1，菌株Bbr81的LC50为8.3×107 mL-1，经过比较菌株Bb05对烟草甲幼2龄幼虫的毒力大于菌株Bbr81。
由图3可见，使用孢子浓度为1.0×108 mL-1的菌株Bb05浸渍接种，烟草甲2龄幼虫于接种3～4 d开始出现活力减弱现象，虫体颜色逐渐变暗，少数幼虫头部和足部出现白色菌丝，开始出现死亡现象，5～6 d后虫体整个变为紫色，体型稍微减小，柔软虫体变僵，菌丝逐渐伸出虫体，并将虫体整个包裹住，随着时间的延长虫体可见大量分生孢子。
3 讨 论
本研究对从田间采集的僵虫进行分离纯化，获得5株白僵菌和5株轮枝菌，并对它们进行生物学性状和致病力研究，发现不同菌株之间的生物学特性存在显著差异，进一步证实了不同菌株对烟草甲的致病力与其生长速率、产孢量、孢子萌发率等生物学性状相关，其中菌株生长速率快、产孢量高、孢子萌发速率高的菌株对烟草甲的毒力更强。这与前人[16-19]的研究结果基本一致。张龙娃等[20]采用不同浓度白僵菌孢子悬浮液对美国白蛾进行毒力试验，发现随孢子浓度升高，真菌对美国白蛾的侵染率呈上升趋势。这与本研究发现的高浓度白僵菌孢子悬浮液对烟草甲2龄幼虫具有更高的致死率基本一致。本研究还发现白僵菌菌株Bb05、Bbr81对烟草甲2龄幼虫具有较高的毒力，这与张晓敏等[12]的报道一致。其中，Bb05菌株在培养15 d时生长最快（直径50.37 mm）、产孢量最高（6.98×107 cm-2），在孢子浓度为108 mL-1时接种对烟草甲2龄幼虫的LT50最短（8.19 d），致病力最强（接种10 d校正死亡率77.78%）。依据接种9 d的结果，Bb05菌株对烟草甲2龄幼虫的LC50为1.2×107 mL-1，较Bbr81更低。
致病力的强弱是评定真菌防治价值的重要标准之一。轮枝菌也是一种广谱高效、应用效果较好的昆虫病原真菌，目前主要用于蚧类、螨类、蚜虫类和粉虱类的绿色防控[19]。但本研究选用的5株轮枝菌菌株对烟草甲2龄幼虫的致病力明显低于白僵菌菌株。初步推测，虽然两种真菌的致病机理相似，但不同菌株在孢子萌发过程中所产生的蛋白酶、脂肪酶以及几丁质酶存在差异[20]，从而导致白僵菌菌株与蜡蚧菌菌株对烟草甲的致病力存在较为明显的差别。
4 结 论
本研究发现白僵菌菌株Bb05、Bbr81对烟草甲2龄幼虫具有较好防治效果，其中Bb05在产孢量、菌落生长速度和毒力等方面更优，可为后续烟草甲雄性成虫携菌侵染雌雄成虫的实仓防治提供理论基础。而在实际应用中适宜真菌萌发的温湿度、药剂剂型、实仓防治以及真菌保存方法等，还需进一步验证。
参考文献
[1] 吴彦，尤春雪，田兆福，等. 牡荆叶挥发油对烟草甲的杀虫活性[J]. 植物保护，2016，42（5）：97-102，109.
WU Y， YOU C X， TIAN Z F， et al. Insecticidal activity of volatile oil from chastetree leaves on tobacco-a[J]. Plant Protection， 2016， 42（5）： 97-102， 109.
[2] EDDE P A. Biology， ecology， and control of Lasioderma serricorne （F.） （Coleoptera： Anobiidae）： a review[J]. Journal of Economic Entomology， 2019， 112（3）： 1011-1031.
[3] MASATOSHI H， KASAISHI Y， HORI M， et al. Effects of the conditions of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Fabricius） （Coleoptera： Anobiidae）， on the knockdown time by phosphine fumigation[J]. Japanese Journal of Applied Entomology and Zoology， 2006， 50（1）： 13-17. [4] HORI M， KASAISHI Y. Estimation of the phosphine resistance level of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Fabricius） （Coleoptera： Anobiidae）， by the knockdown time of adult[J]. Applied Entomology and Zoology， 2005， 40（4）： 557-561.
[5] IMAI T， HARADA H. Low-temperature as an alternative to fumigation to disinfest stored tobacco of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （F.） （Coleoptera： Anobiidae）[J]. Applied Entomology and Zoology， 2006， 41（1）： 87-91.
[6] SAGLAM O， EDDE P A， PHILLIPS T W. Resistance of Lasioderma serricorne （Coleoptera： Anobiidae） to fumigation with phosphine[J]. Journal of Econmic Entomology， 2015， 108（5）： 2489-2495.
[7] 蒲蛰龙，李增智. 昆虫真菌学[M]. 合肥：安徽科学技术出版社，1996.
PU Z L， LI Z Z. Insect mycology[M]. Hefei： Anhui Publishing House of Science and Technology， 1996.
[8] SHINODA K; FUJISAKI K. Effect of adult feeding on longevity and fecundity of the cigarette beetle， Lasioderma serricorne F. （Coleoptera ： Anobiidae）[J]. Applied Entomology and Zoology， 2001， 36（2）： 219-223.
[9] 楊绍佳，邱雯雯，史梦竹，等. 不同湿度下烟草甲实验种群两性生命表的构建[J]. 福建农业学报，2018，33（2）：177-185.
YANG S J， QIU W W， SHI M Z， et al. Construction of gender life table in tobacco a experimental population under different humidity[J]. Journal of Fujian Agriculture， 2018， 33（2）： 177-185.
[10] 郭军，戴仁怀，杨洪，等. 烟草甲的优良寄生蜂象虫金小蜂的生物学特性[J]. 中国生物防治学报，2018，34（5）：649-655.
GUO J， DAI R H， YANG H， et al. Biological characteristics of Anisopteromalus calandrae （Howard） （Hymenoptera： Pteromalidae： Anisopteromalus）， parasitized on Lasioderma serricorne （Fabricius）[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2018， 34（5）： 649-655.
[11] 张艳梅，谢映平，薛皎亮，等. 油松毛虫受球孢白僵菌感染的组织病理学变化[J]. 昆虫学报，2011，54（5）：531-539.
ZHANG Y M， XIE Y P， XUE J L， et al. Histopathological changes in Dendrolimus tabulaeformis （Lepidoptera：Lasiocampidae） infected by Beauveria bassiana[J]. Acta Entomologica Sinica， 2011， 54（5）： 531-539.
[12] 张晓敏，杨辉，施鸣，等. 防治烟草甲白僵菌的仓储应用菌株选育[J]. 中国烟草学报，2015，21（2）：79-84.
ZHANG X M， YANG H， SHI M， et al. Screening and breeding of Beauveria bassiana for controlling tobacco beetles[J]. Chinese Tobacco Science， 2015， 21（2）： 79-84.
[13] 唐启义，冯明光. 实用统计分析及其DPS数据处理系统[M]. 北京：科学出版社，2002.
TANG Q Y， FENG M G. DPS data processing system for practical statistics[M]. Beijing： Science Press， 2002.
[14] TSUCHIYA S， KASAISHI Y， HARADA H， et al. Assessment of the efficacy of Japanese Bacillus thuringiensis isolates against the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Coleoptera ： Anobiidae）[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2002， 81（2）： 122-126. [15] HORI M， MIWA M， LIZAWA H. Host suitability of various stored food products for the cigarette beetle， Lasioderma serricorne （Coleoptera： Anobiidae）[J]. Applied Entomology and Zoology， 2011， 46（4）： 463-469.
[16] 孟祥坤，朱超，于新，等. 高毒力白僵菌的筛选及对花生甜菜夜蛾的致病力[J]. 中国生物防治学报，2018，34（2）：259-265.
MENG X K， ZHU C， YU X， et al. Screening of highly toxic Beauveria bassiana and its pathogenicity against peanut beet night moth[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2008， 34（2）： 259-265.
[17] 雷妍圓，吕利华，何余容，等. 球孢白僵菌生物学特性与其对小菜蛾致病力相关性分析[J]. 中国生物防治，2010，26（2）：143-148.
LEI Y Y， LYU L H， HE Y R， et al. Correlation between biological characteristics of Beauveria bassiana and its virulence to plutella xylostella[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2010， 26（2）： 143-148.
[18] 胡本进，徐丽娜，胡飞，等. 稻蛀茎夜蛾高致病性球孢白僵菌菌株筛选[J]. 中国生物防治学报，2015，31（2）：280-283.
HU B J， XU L N， HU F， et al. Screening of highly pathogenic strains of Beauveria bassiana against Sesamia inferens[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2015， 31（2）： 280-283.
[19] 蔡春霞，李茂业，陈德鑫，等. 八株蜡蚧轮枝菌的生物学特性及其对烟蚜致病性的影响[J]. 中国烟草科学，2018，39（5）：86-93.
CAI C X， LI M Y， CHEN D X， et al. Biological characteristics of eight Verticillium lecanii and their effects on the pathogenicity against Myzus persicae aphids[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（5）： 86-93.
[20] 杨晓昱，于蓉蓉. 蜡蚧轮枝菌防治植物病虫害研究进展[J]. 中国植保导刊，2005（5）：9-11.
YANG X Y， YU R R. Review on research progress on the control of crop pests by using Verticillium lecanii[J]. China Plant Protection， 2005（5）： 9-11.