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摘要[目的]分析东北红豆杉在引种地新疆石河子的抗寒性。[方法]通过5个低温处理试验，测定叶片叶绿素含量、丙二醛（MDA）、游离脯氨酸（Pro）、超氧物歧化酶（SOD）活性、质膜透性、可溶性糖（SS）指标。[结果]随着温度降低，东北红豆杉叶片内叶绿素含量和SOD活性依次降低，而质膜透性、Pro、MDA和SS含量递增。[结论]东北红豆杉对-30 ℃低温具有较好的抗逆性。
关键词东北红豆杉；抗寒性；低温
中图分类号S791.49文献标识码A文章编号0517-6611（2016）16-174-03
Abstract[Objective] To analyze the cold resistance of Taxus cuspidate Sieb. et Zucc. in Shihezi City of Xinjiang Province. [Method] Five lowtemperature treatments were designed to test the leaf chlorophyll content， MDA content， free proline content， SOD activity， membrane permeability and soluble sugar content. [Result] With the decrease of temperature， the chlorophyll content and SOD activity in T. cuspidate leaves reduced， but membrane permeability， free proline， MDA content and soluble sugar content enhanced. [Conclusion] T. cuspidate has relatively good cold resistance to -30 ℃ low temperature.
Key wordsTaxus cuspidate Sieb. et Zucc.； Cold resistance； Low treatment
东北红豆杉（Taxus cuspidate Sieb. et Zucc.）又称紫杉、赤柏松，为红豆杉科红豆杉属常绿针叶乔木，原产于我国东北的长白山等地。东北红豆杉兼具药用、材用和观赏价值[1]，其自然分布零星、稀少，是濒临灭绝的国家一级保护树种。为了增加东北红豆杉种群数量，扩大其地理分布范围，保护并更好地开发利用东北红豆杉资源，科研人员将东北红豆杉引种到新疆的石河子。低温冻害等非生物胁迫是新疆常见的逆境因子，也是影响新疆植物正常生长发育的主要环境因素[2-4]。为给石河子开展东北红豆杉的引种驯化、繁育促培及种植推广应用提供科学依据，笔者就引种的东北红豆杉苗对新疆低温冻害等逆境因子的生理响应进行了试验分析。
1材料与方法
1.1供试材料试验所用的植物材料为新疆石河子市园林研究所从东北吉林通化长白山区引种栽培的5年生东北红豆杉。将东北红豆杉苗栽培在规格为21 cm×21 cm盆钵内，每钵留苗1株，置于露地养护。盆栽土壤取自石河子市园林研究所院内肥料池，按肥料土∶腐熟锯末∶细沙=10∶3∶1配制。
1.2试验设计设置5个温度处理，分别为20（CK）、-30、-35、-40、-45 ℃，记为处理①～⑤。将东北红豆杉钵苗先置于光照培养箱中降温至0 ℃后，再搬入超低温冰柜中开始进行低温处理，各处理采取逐渐降温的方法（即每天降温5 ℃，待2 d后小苗适应低温，继续降温）。低温处理2～3 d后取样，在实验室内分别对叶片质膜透性（电导率）、叶绿素、超氧物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、游离脯氨酸（Pro）含量、可溶性糖（SS）含量进行测试分析。
1.3取样方法
1.3.1叶绿素测定取样。从每个处理2个重复中随机选定2株幼苗，摘下功能叶片，剪碎，测定叶绿素a、b含量。
1.3.2酶活性测定取样。摘取处理后的东北红豆杉功能叶片，剪碎，定量称取后，用锡箔纸包裹，编号，液氮速冻，置于-80 ℃超低温冰箱中冷冻储藏，待测定。
1.4测定项目及方法
1.4.1叶绿素含量。叶绿素含量测定采用乙醇丙酮混合法[5]。称取0.20 g新鲜叶片于25 mL容量瓶内，加乙醇（95%）∶丙酮（50%）=1∶1的浸提液25 mL，封口，于暗处浸提36 h，至叶片呈白色，其间每隔12 h振荡片刻，使色素均匀分布于乙醇丙酮混合溶液中，分别在663、645 nm处测定吸光度。
叶绿素=叶绿素a+叶绿素b （3）
叶绿素含量=色素的浓度×提取液体积×稀释倍数 / 样品鲜重 （4）
1.4.2丙二醛（MDA）含量。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[6]。吸取预先提取的粗酶液2 mL，加入2 mL 0.6%的TBA（溶于10%的三氯乙酸）溶液，将混合物置于沸水浴中反应15 min，然后快速在冰浴上冷却，在40 000 r/min离心10 min，取上清液于450、532、600 nm波长下测定吸光度。根据MDA在532 nm处的毫摩尔消光系数为155换算出提取液中MDA浓度。
1.4.3脯氨酸（Pro）含量。采用茚三酮比色法[7]测定Pro的含量。取0.400～0.450 g鲜样于大试管中，加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10 min，待冷却至室温后，吸取上清液2 mL，加2 mL冰乙酸和3 mL 2.5%酸性茚三酮显色液，于沸水浴中加热40 min，冷却后向各试管中加入5 mL甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静止待分层后吸取甲苯层，在波长520 nm下比色。 1.4.4超氧化物歧化酶（SOD）活性。用氮蓝四唑光化学还原法[7]测定SOD活性。酶液提取：称取0.400～0.450 g叶样，加入少许石英砂、1%（w/v）聚乙烯聚吡咯烷酮 （PVPP），分次加入8 mL 50 mmol/L pH 6.8磷酸缓冲液于冰浴上研磨成匀浆，4 ℃下离心20 min，上清液用于SOD活性的测定。
1.4.5质膜透性。用电导率仪法测定质膜透性[5]。将东北红豆杉功能叶用去离子水清洗3次以去除叶片表面黏附的电解质。用直径5 mm的打孔器避开主脉取样，混合均匀。每个重复取6片放入50 mL三角瓶中，装30 mL去离子水，在25 ℃旋转摇床上温浴24 h之后测定电导率（Lt），然后煮沸20 min，用流动自来水进行冷却，立即测定各处理的煮后电导率（Lo）。
质膜透性=Lt/Lo×100% （5）
1.4.6可溶性糖（SS）含量。SS含量的测定采用蒽酮比色法[8]。
1.4.6.1标准曲线的制作。
（1）1%蔗糖标准液。将分析纯蔗糖在80 ℃下烘至恒重，精确称取1.000 g。加少量水溶解，转入100 mL容量瓶中，加入0.5 mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。
（2）100 μg/L蔗糖标准液。精确吸取1%蔗糖标准液1 mL加入100 mL容量瓶中，加水至刻度。取20 mL刻度试管11支，从0～10分别编号，分为6组（含空白），对应6个处理，除空白外，各处理重复2次，按表1加入溶液和水。
按顺序向试管中加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5 mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1 min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630 nm波长下测其吸光度，以吸光度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。
1.4.6.2SS的提取。取新鲜东北红豆杉叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30 g，共3份。分别放入3支刻度试管中，加入5～10 mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min（提取2次），将提取液过滤入25 mL容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。
1.4.6.3显色测定。吸取样品提取液0.5 mL于20 mL刻度试管中（重复3次），加蒸馏水1.5 mL，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的吸光度，计算SS含量。
SS含量=从回归方程求得糖的量/吸取样品液体积×提取液量×稀释倍数/（样品干重×106）×100% （6）
1.5数据处理数据采用SPSS软件（10.0）进行统计分析，采用Excel生成图表。
2结果与分析
2.1低温对东北红豆杉叶片内叶绿素含量的影响由表2可知，低温对东北红豆杉叶片内叶绿素a含量有明显影响。随着温度的降低，叶绿素a含量依次递减。其中，叶绿素a含量最低的为-45 ℃低温处理，比对照降低0.677 mg/g，为对照的46.73%。低温对东北红豆杉叶片内叶绿素b含量的影响与叶绿素a基本相似，即随着温度的降低，叶绿素b含量依次递减，其中，叶绿素b含量最低的仍为-45 ℃低温处理，比对照降低0.302 mg/g，为对照的27.40%。低温对东北红豆杉叶片内叶绿素含量的影响为随着温度的降低，叶绿素含量依次递减，-45 ℃低温处理比对照降低0.979 mg/g，为对照的42.00%。
2.2低温对东北红豆杉叶片内MDA含量的影响由图1可知，随着低温冻害的加剧，东北红豆杉叶片内MDA含量逐渐增加，其中，-30 ℃低温处理MDA含量较对照上升0.9 μmol/L，而-45 ℃低温处理MDA含量较对照增加5.8 μmol/L，说明随着温度降低，东北红豆杉膜脂过氧化作用越来越严重。
2.3低温对东北红豆杉叶片内Pro含量的影响由图2可知，在低温胁迫条件下，东北红豆杉体内Pro含量迅速上升。-45 ℃低温处理时，Pro含量为对照的5.31倍。
2.4低温对东北红豆杉叶片内SOD活性的影响由图3可知，低温能增加东北红豆杉体内活性氧的含量，降低了SOD活性。随着处理温度的降低，SOD活性呈下降趋势。与对照相比，随着温度的降低，SOD活性降低了16.55%～69.01%，下降最显著为-45 ℃低温处理。
2.5低温对东北红豆杉叶片质膜透性的影响由图4可知，低温对东北红豆杉叶片质膜透性有明显影响。随着温度的降低，质膜透性受影响越大。相比于对照，各低温处理叶片质膜透性比对照增大0.73%～167.99%。-30 ℃低温处理时，与对照差异不明显，说明东北红豆杉对-30 ℃低温具有较好的抗逆性。
2.6低温对东北红豆杉叶片内SS含量的影响由图4可知，在温度逐渐降低的条件下，东北红豆杉叶片内SS含量逐渐增加。与对照比较，随着温度的降低，SS含量增加102.39%～121.56%。低温处理与对照相比，SS含量均显示出显著性差异，而低温处理之间SS含量差异不显著。由此说明，东北红豆杉作为抗寒性强的植物，其体内SS含量的增加，对提高东北红豆杉的抗寒性具有重要的作用。
3小结与讨论
该研究表明，随着温度降低，东北红豆杉叶片内叶绿素含量和SOD活性依次降低，而质膜透性、Pro、MDA和SS含量递增。在该低温试验中，东北红豆杉表现出了较强的抗寒性，对-30 ℃低温具有较好的抗逆性。该试验低温处理采取逐渐降温的方法，降温幅度均匀，且每次降温持续时间基本一致，这与自然降温过程有差异，今后再做东北红豆杉抗寒性试验，应注意对自然降温过程的全真模拟及进行综合分析。
安徽农业科学2016年参考文献
[1] 周志强，胡丹，刘彤.天然东北红豆杉种群生殖力与开花结实的特性[J].林业科学，2009，45（5）：80-86.
[2] 姚丽花.新疆奎屯垦区近10年棉花苗期低温冷（冻）害天气分析[C]//第28届中国气象学会年会：S11气象与现代农业.厦门：中国气象学会，2011.
[3] 吉春容，邹陈，陈丛敏，等.新疆特色林果冻害研究概述[J].沙漠与绿洲气象，2011，5（4）：1-4.
[4] 孙晓硕.新疆北疆地区冬季葡萄冻害成因及预防措施[J].林业科学，2015（5）：116-117.
[5] 郝建军.植物生理学实验技术[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，2001.
[6] 刘成运，孟庆梅.冷害条件下凤眼莲某些生理特性变化的研究[J].武汉植物学研究，1993，11（4）：345-354.
[7] 王易振，杨治国，曾祥琼，等.低温处理对青蒿叶片脯氨酸、SOD和CAT的含量及蛋白质的影响[J].基因组学与应用生物学，2010，29（5）：927-930.
[8] WANG X G，SHEN L T， YAO J H， et al. Physiological and biochemical effects of essential oils on seed potato storage[J]. Acta phytophylacica sinica， 2016，4（13）：300-306.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2016，44（16）：177-178，182
关键词东北红豆杉；抗寒性；低温
中图分类号S791.49文献标识码A文章编号0517-6611（2016）16-174-03
Abstract[Objective] To analyze the cold resistance of Taxus cuspidate Sieb. et Zucc. in Shihezi City of Xinjiang Province. [Method] Five lowtemperature treatments were designed to test the leaf chlorophyll content， MDA content， free proline content， SOD activity， membrane permeability and soluble sugar content. [Result] With the decrease of temperature， the chlorophyll content and SOD activity in T. cuspidate leaves reduced， but membrane permeability， free proline， MDA content and soluble sugar content enhanced. [Conclusion] T. cuspidate has relatively good cold resistance to -30 ℃ low temperature.
Key wordsTaxus cuspidate Sieb. et Zucc.； Cold resistance； Low treatment
东北红豆杉（Taxus cuspidate Sieb. et Zucc.）又称紫杉、赤柏松，为红豆杉科红豆杉属常绿针叶乔木，原产于我国东北的长白山等地。东北红豆杉兼具药用、材用和观赏价值[1]，其自然分布零星、稀少，是濒临灭绝的国家一级保护树种。为了增加东北红豆杉种群数量，扩大其地理分布范围，保护并更好地开发利用东北红豆杉资源，科研人员将东北红豆杉引种到新疆的石河子。低温冻害等非生物胁迫是新疆常见的逆境因子，也是影响新疆植物正常生长发育的主要环境因素[2-4]。为给石河子开展东北红豆杉的引种驯化、繁育促培及种植推广应用提供科学依据，笔者就引种的东北红豆杉苗对新疆低温冻害等逆境因子的生理响应进行了试验分析。
1材料与方法
1.1供试材料试验所用的植物材料为新疆石河子市园林研究所从东北吉林通化长白山区引种栽培的5年生东北红豆杉。将东北红豆杉苗栽培在规格为21 cm×21 cm盆钵内，每钵留苗1株，置于露地养护。盆栽土壤取自石河子市园林研究所院内肥料池，按肥料土∶腐熟锯末∶细沙=10∶3∶1配制。
1.2试验设计设置5个温度处理，分别为20（CK）、-30、-35、-40、-45 ℃，记为处理①～⑤。将东北红豆杉钵苗先置于光照培养箱中降温至0 ℃后，再搬入超低温冰柜中开始进行低温处理，各处理采取逐渐降温的方法（即每天降温5 ℃，待2 d后小苗适应低温，继续降温）。低温处理2～3 d后取样，在实验室内分别对叶片质膜透性（电导率）、叶绿素、超氧物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、游离脯氨酸（Pro）含量、可溶性糖（SS）含量进行测试分析。
1.3取样方法
1.3.1叶绿素测定取样。从每个处理2个重复中随机选定2株幼苗，摘下功能叶片，剪碎，测定叶绿素a、b含量。
1.3.2酶活性测定取样。摘取处理后的东北红豆杉功能叶片，剪碎，定量称取后，用锡箔纸包裹，编号，液氮速冻，置于-80 ℃超低温冰箱中冷冻储藏，待测定。
1.4测定项目及方法
1.4.1叶绿素含量。叶绿素含量测定采用乙醇丙酮混合法[5]。称取0.20 g新鲜叶片于25 mL容量瓶内，加乙醇（95%）∶丙酮（50%）=1∶1的浸提液25 mL，封口，于暗处浸提36 h，至叶片呈白色，其间每隔12 h振荡片刻，使色素均匀分布于乙醇丙酮混合溶液中，分别在663、645 nm处测定吸光度。
叶绿素=叶绿素a+叶绿素b （3）
叶绿素含量=色素的浓度×提取液体积×稀释倍数 / 样品鲜重 （4）
1.4.2丙二醛（MDA）含量。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[6]。吸取预先提取的粗酶液2 mL，加入2 mL 0.6%的TBA（溶于10%的三氯乙酸）溶液，将混合物置于沸水浴中反应15 min，然后快速在冰浴上冷却，在40 000 r/min离心10 min，取上清液于450、532、600 nm波长下测定吸光度。根据MDA在532 nm处的毫摩尔消光系数为155换算出提取液中MDA浓度。
1.4.3脯氨酸（Pro）含量。采用茚三酮比色法[7]测定Pro的含量。取0.400～0.450 g鲜样于大试管中，加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10 min，待冷却至室温后，吸取上清液2 mL，加2 mL冰乙酸和3 mL 2.5%酸性茚三酮显色液，于沸水浴中加热40 min，冷却后向各试管中加入5 mL甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静止待分层后吸取甲苯层，在波长520 nm下比色。 1.4.4超氧化物歧化酶（SOD）活性。用氮蓝四唑光化学还原法[7]测定SOD活性。酶液提取：称取0.400～0.450 g叶样，加入少许石英砂、1%（w/v）聚乙烯聚吡咯烷酮 （PVPP），分次加入8 mL 50 mmol/L pH 6.8磷酸缓冲液于冰浴上研磨成匀浆，4 ℃下离心20 min，上清液用于SOD活性的测定。
1.4.5质膜透性。用电导率仪法测定质膜透性[5]。将东北红豆杉功能叶用去离子水清洗3次以去除叶片表面黏附的电解质。用直径5 mm的打孔器避开主脉取样，混合均匀。每个重复取6片放入50 mL三角瓶中，装30 mL去离子水，在25 ℃旋转摇床上温浴24 h之后测定电导率（Lt），然后煮沸20 min，用流动自来水进行冷却，立即测定各处理的煮后电导率（Lo）。
质膜透性=Lt/Lo×100% （5）
1.4.6可溶性糖（SS）含量。SS含量的测定采用蒽酮比色法[8]。
1.4.6.1标准曲线的制作。
（1）1%蔗糖标准液。将分析纯蔗糖在80 ℃下烘至恒重，精确称取1.000 g。加少量水溶解，转入100 mL容量瓶中，加入0.5 mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。
（2）100 μg/L蔗糖标准液。精确吸取1%蔗糖标准液1 mL加入100 mL容量瓶中，加水至刻度。取20 mL刻度试管11支，从0～10分别编号，分为6组（含空白），对应6个处理，除空白外，各处理重复2次，按表1加入溶液和水。
按顺序向试管中加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5 mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1 min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630 nm波长下测其吸光度，以吸光度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。
1.4.6.2SS的提取。取新鲜东北红豆杉叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30 g，共3份。分别放入3支刻度试管中，加入5～10 mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min（提取2次），将提取液过滤入25 mL容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。
1.4.6.3显色测定。吸取样品提取液0.5 mL于20 mL刻度试管中（重复3次），加蒸馏水1.5 mL，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的吸光度，计算SS含量。
SS含量=从回归方程求得糖的量/吸取样品液体积×提取液量×稀释倍数/（样品干重×106）×100% （6）
1.5数据处理数据采用SPSS软件（10.0）进行统计分析，采用Excel生成图表。
2结果与分析
2.1低温对东北红豆杉叶片内叶绿素含量的影响由表2可知，低温对东北红豆杉叶片内叶绿素a含量有明显影响。随着温度的降低，叶绿素a含量依次递减。其中，叶绿素a含量最低的为-45 ℃低温处理，比对照降低0.677 mg/g，为对照的46.73%。低温对东北红豆杉叶片内叶绿素b含量的影响与叶绿素a基本相似，即随着温度的降低，叶绿素b含量依次递减，其中，叶绿素b含量最低的仍为-45 ℃低温处理，比对照降低0.302 mg/g，为对照的27.40%。低温对东北红豆杉叶片内叶绿素含量的影响为随着温度的降低，叶绿素含量依次递减，-45 ℃低温处理比对照降低0.979 mg/g，为对照的42.00%。
2.2低温对东北红豆杉叶片内MDA含量的影响由图1可知，随着低温冻害的加剧，东北红豆杉叶片内MDA含量逐渐增加，其中，-30 ℃低温处理MDA含量较对照上升0.9 μmol/L，而-45 ℃低温处理MDA含量较对照增加5.8 μmol/L，说明随着温度降低，东北红豆杉膜脂过氧化作用越来越严重。
2.3低温对东北红豆杉叶片内Pro含量的影响由图2可知，在低温胁迫条件下，东北红豆杉体内Pro含量迅速上升。-45 ℃低温处理时，Pro含量为对照的5.31倍。
2.4低温对东北红豆杉叶片内SOD活性的影响由图3可知，低温能增加东北红豆杉体内活性氧的含量，降低了SOD活性。随着处理温度的降低，SOD活性呈下降趋势。与对照相比，随着温度的降低，SOD活性降低了16.55%～69.01%，下降最显著为-45 ℃低温处理。
2.5低温对东北红豆杉叶片质膜透性的影响由图4可知，低温对东北红豆杉叶片质膜透性有明显影响。随着温度的降低，质膜透性受影响越大。相比于对照，各低温处理叶片质膜透性比对照增大0.73%～167.99%。-30 ℃低温处理时，与对照差异不明显，说明东北红豆杉对-30 ℃低温具有较好的抗逆性。
2.6低温对东北红豆杉叶片内SS含量的影响由图4可知，在温度逐渐降低的条件下，东北红豆杉叶片内SS含量逐渐增加。与对照比较，随着温度的降低，SS含量增加102.39%～121.56%。低温处理与对照相比，SS含量均显示出显著性差异，而低温处理之间SS含量差异不显著。由此说明，东北红豆杉作为抗寒性强的植物，其体内SS含量的增加，对提高东北红豆杉的抗寒性具有重要的作用。
3小结与讨论
该研究表明，随着温度降低，东北红豆杉叶片内叶绿素含量和SOD活性依次降低，而质膜透性、Pro、MDA和SS含量递增。在该低温试验中，东北红豆杉表现出了较强的抗寒性，对-30 ℃低温具有较好的抗逆性。该试验低温处理采取逐渐降温的方法，降温幅度均匀，且每次降温持续时间基本一致，这与自然降温过程有差异，今后再做东北红豆杉抗寒性试验，应注意对自然降温过程的全真模拟及进行综合分析。
安徽农业科学2016年参考文献
[1] 周志强，胡丹，刘彤.天然东北红豆杉种群生殖力与开花结实的特性[J].林业科学，2009，45（5）：80-86.
[2] 姚丽花.新疆奎屯垦区近10年棉花苗期低温冷（冻）害天气分析[C]//第28届中国气象学会年会：S11气象与现代农业.厦门：中国气象学会，2011.
[3] 吉春容，邹陈，陈丛敏，等.新疆特色林果冻害研究概述[J].沙漠与绿洲气象，2011，5（4）：1-4.
[4] 孙晓硕.新疆北疆地区冬季葡萄冻害成因及预防措施[J].林业科学，2015（5）：116-117.
[5] 郝建军.植物生理学实验技术[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，2001.
[6] 刘成运，孟庆梅.冷害条件下凤眼莲某些生理特性变化的研究[J].武汉植物学研究，1993，11（4）：345-354.
[7] 王易振，杨治国，曾祥琼，等.低温处理对青蒿叶片脯氨酸、SOD和CAT的含量及蛋白质的影响[J].基因组学与应用生物学，2010，29（5）：927-930.
[8] WANG X G，SHEN L T， YAO J H， et al. Physiological and biochemical effects of essential oils on seed potato storage[J]. Acta phytophylacica sinica， 2016，4（13）：300-306.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2016，44（16）：177-178，182