论文部分内容阅读
（黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨 150040）
摘要
［目的］建立绶草高频再生体系。［方法］以野生绶草的花序轴为外植体，对外植体进行消毒和预培养后，以MS为基本培养基，添加不同浓度的6BA筛选最适诱导培养基；以MS为基本培养基，添加不同浓度6BA和IAA筛选最适增殖培养基；以1/2 MS为基本培养基，添加不同浓度NAA筛选最适生根培养基。［结果］最适诱导培养基为MS+6BA2.0,最适增殖培养基为MS+6BA1.5+IAA0.4，最适生根培养基为1/2MS+NAA1.5。［结论］该研究对绶草优良品种的改良和次级代谢产物研究有重要意义。
关键词 绶草；再生体系；诱导
中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06162-01
On Establishing a High Frequency Regeneration System of Spiranthes sinensis
LI Huiling, CHENG Yupeng et al
(College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang 150040)
Abstract ［Objective］ To establish a high frequency regeneration system of Spiranthes sinensis. ［Method］ With rachis of wild Spiranthes sinensis as explant, disinfection and preculture was conducted. With MS as basic medium, adding different concentration 6BA, the optimum induction medium was obtained; with MS as basic medium, adding different concentration 6BA and IAA, the optimum proliferation medium was selected; with 1/2 MS as basic medium, add different concentration NAA for screen out the optimal rooting medium. ［Result］ The optimum medium for induction is MS+6BA 2.0; the optimum medium for proliferation is MS+6BA 1.5+IAA 0.4 and 1/2 MS+NAA 1.5 is the best rooting medium. ［Conclusion］ The study has significance for improvement and secondary metatolites research of Spiranthes sinensis fine cultivar.
Key words Spiranthes sinensis; Regeneration system; Induction
基金项目 黑龙江中医药大学校基金（200710）黑龙江中医药大学校基金（201004）；黑龙江中医药大学优秀创新人才支持计划（2012RCQ13）。
作者简介
李慧玲（1979-），女，黑龙江北安人，硕士，讲师，从事环境微生物和生物药物研究。*通讯作者，博士，副教授，从事生物制药研究。
收稿日期 20140526
绶草（Spiranthes sinensis）属于兰科绶草属植物，别名盘龙参、龙抱柱、猪鞭草等，原国家林业部颁布的《野生植物保护名录》中将其列为二级保护植物，现已列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》［1］。绶草生长于海拔400~3 200 m的山坡林下或草地，广泛分布于我国各省区。绶草根或全草入药，具有滋阴益气、补肾壮阳、凉血解毒、润肺止咳、消炎解毒、强筋骨、祛风湿之功效。用于病后气血两虚、少气无力、阴虚内热、神经衰弱、肺结核咯血、小儿季热、糖尿病、遗精、头晕、失眠等症状［2］。
绶草中已经报道分离出多种化合物：黄酮类化合物spirathetinⅠ、阿魏酸酯如阿魏酸二十八醇酯(octacosylferulate)、二氢菲类衍生物和甾醇类等［3-5］。其中阿魏酸二十八醇酯已被证实具有抗肿瘤的作用［3］，二氢菲类衍生物可能具抗乙肝病毒和抗SARS病毒的作用［6］。由于绶草植株瘦小、野生资源较少、有效成分很难提取和富集，这些都限制绶草药用价值的进一步开发。因此，建立绶草高频再生体系，对其优良品种的改良和次级代谢产物的研究具有重要意义。
1材料与方法
1.1材料
以黑龙江镜泊湖绶草为材料，取其花序轴为外植体。
1.2 方法
1.2.1
外植体消毒和预培养。将花序轴剪去小苞叶后用流水冲洗15 min，然后用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗4~5次。利用0.1%的氯化汞消毒3、5、7和10 min，用无菌水冲洗4~5次，将花序轴剪成1~2 cm小段接种于MS培养基中预培养。每个处理接种30个外植体，培养25 d，统计污染率、死亡率和成活率。
1.2.2
外植体的诱导培养。将预培养后生长良好的外植体接种于诱导培养基，诱导培养基以MS为基本培养基，添加不同浓度的6BA（0.2、0.6、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L），每种培养基接种30个外植体。
1.2.3
诱导芽的增殖培养。将诱导产生的芽接种于增殖培养基，增殖培养基以MS为基本培养基，添加不同浓度的6BA（0.6、1.0、1.5、3.0 mg/L）和IAA（0、0.2、0.4、0.6 mg/L）。每种培养基接种30个诱导芽。
1.2.4
诱导芽的生根培养。
将2 cm以上的芽接种于生根培养基中，以1/2 MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L），每种培养基接种30个芽。
1.3 培养条件
培养基添加蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH值为5.8，培养温度25 ℃，光照2 000 lx，每天12 h光照/12 h黑暗。
2 结果与分析
2.1 不同消毒方法对预培养的影响
外植体培养25 d后，消毒结果如表1所示，0.1%的氯化汞消毒效果随灭菌时间的增加而加强，外植体消毒10 min污染率为0，消毒7 min外植体出现枯死，消毒10 min枯死数量明显增加。鉴于外植体在消毒7 min时，污染和死亡较少，成活率也较高，所以0.1%氯化汞消毒7 min效果较好。
2.2 最佳诱导培养基的选择
外植体接种于诱导培养基15~18 d后，诱导芽生长情况如表2所示，6BA浓度在0.2 mg/L时没有分化芽；当浓度达到0.6 mg/L时开始分化芽，但是数量较少；随着6BA浓度的升高芽诱导率增加，当6BA浓度达到2.0 mg/L时芽诱导率达83.3%。因此外植体接种于培养基MS+6BA2.0最适宜芽的诱导。
表1 外植体的消毒处理
消毒时间∥min 接种数∥个 污染率∥%死亡率∥%成活率∥%
3 30 75 0 25
5 30 34 0 66
7 30 10 13 77
10 30 0 48 52
表2 外植体的芽诱导率
6BA浓度∥mg/L 接种数∥个 形成芽∥个芽诱导率∥%
0.2 30 0 0
0.6 30 2 6.7
1.0 30 15 50
1.5 30 18 60
2.0 30 25 83.3
2.3 最佳增殖培养基的选择
诱导芽在增殖培养基中生长4~5周后的芽增殖倍数结果见表3。表3表明，6BA浓度为1.5 mg/L时芽的增殖倍数高于6BA其他试验组，培养基中添加1.5 mg/L的6BA和0.4 mg/L的IAA时芽增殖倍数最高，因此最佳增殖培养基是MS+6BA1.5+IAA0.4。
表3 不同培养基的芽增殖倍数
IAA浓度mg/L 6BA浓度∥mg/L
0.6 1.0 1.5 3.0
0 2.4 2.7 3.3 1.2
0.2 1.7 2.9 4.6 1.5
0.4 1.3 3.2 4.7 1.8
0.6 1.1 2.1 4.1 2.3
2.4 最佳诱导生根培养基的选择
增殖后的芽转入生根培养基中培养15~17 d开始生根，3周以后观察生根情况。结果表明，NAA浓度是1.5 mg/L时生根率较高，所以最佳生根培养基是1/2MS+NAA1.5。
2.5 炼苗和移栽
组培苗生长到4~6 cm时，生根3~4条进行炼苗，打开培养瓶盖2~3 d，取出试管苗用水冲洗干净，洗去根部残留的培养基，移栽到草炭与蛭石（2∶1）中，注意保持适宜的湿度和遮阴，每周喷施1次MS培养基中的大量元素。经过30 d左右，当幼苗粗壮、挺拔、根系发达后移栽到土壤中。
3讨论
绶草属于兰科植物，在组织培养过程中经常会出现染菌、褐化等现象，究其原因主要与品种、取材部位和取材时间、外植体大小及伤害程度有关［7］。所以，在培养过程中需要严格遵照无菌操作规程，降低污染率。
6BA是细胞分裂素，主要作用是促进细胞分裂和诱导芽的分化，所以诱导芽的生成经常在培养基中添加6BA。NAA是生长素，可以诱导生根，效果较好，所以该研究利用NAA诱导生根达到了预期目的。该研究表明，进行绶草组织培养时，最适诱导培养基为MS+6BA2.0，最适增殖培养基为MS+6BA1.5+IAA0.4，最适生根培养基为1/2MS+NAA1.5。
参考文献
［1］ 国家环境保护总局.中国珍稀濒危保护植物名录(第一册)［M］.北京:中国科学院植物研究所，1987.
［2］《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海:上海科学技术出版社，1999：7916．
［3］ LIN Y L，HUANG R L，DON M J，et al.Dihydrophenanthrenes from Spiranthes sinensis［J］.Journal of Natural Products，2000，63(12):1608-1610.
［4］ LIN Y L，WANG W Y，KUO Y H.Homocyclotirucallane and two dihydrophenanthrenes from Spiranthes sinensis［J］.Chemical &Pharmaceutical Bulletin，2001，49(9):1098-1101.
［5］ PENG J Y，HAN X，XU L N，et al.Two new prenylated coumarins from Spiranthes sinensis (Pers.) Ames［J］.Journal of Asian Natural Products Research，2008，10(3): 256-259.
［6］ LINY L,CHEN W P，ABDULGAFOR D M.Dihydro phenanthrenenes from Bletilla formosana［J］.Chem Pharm Bul，2005，53 (9):1111-1113.
［7］ 陈少珍，卜朝阳，闭志强，等.兰花组织培养中常见问题及解决方法［J］.广西农业科学，2006，37(1):72-74.
摘要
［目的］建立绶草高频再生体系。［方法］以野生绶草的花序轴为外植体，对外植体进行消毒和预培养后，以MS为基本培养基，添加不同浓度的6BA筛选最适诱导培养基；以MS为基本培养基，添加不同浓度6BA和IAA筛选最适增殖培养基；以1/2 MS为基本培养基，添加不同浓度NAA筛选最适生根培养基。［结果］最适诱导培养基为MS+6BA2.0,最适增殖培养基为MS+6BA1.5+IAA0.4，最适生根培养基为1/2MS+NAA1.5。［结论］该研究对绶草优良品种的改良和次级代谢产物研究有重要意义。
关键词 绶草；再生体系；诱导
中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06162-01
On Establishing a High Frequency Regeneration System of Spiranthes sinensis
LI Huiling, CHENG Yupeng et al
(College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang 150040)
Abstract ［Objective］ To establish a high frequency regeneration system of Spiranthes sinensis. ［Method］ With rachis of wild Spiranthes sinensis as explant, disinfection and preculture was conducted. With MS as basic medium, adding different concentration 6BA, the optimum induction medium was obtained; with MS as basic medium, adding different concentration 6BA and IAA, the optimum proliferation medium was selected; with 1/2 MS as basic medium, add different concentration NAA for screen out the optimal rooting medium. ［Result］ The optimum medium for induction is MS+6BA 2.0; the optimum medium for proliferation is MS+6BA 1.5+IAA 0.4 and 1/2 MS+NAA 1.5 is the best rooting medium. ［Conclusion］ The study has significance for improvement and secondary metatolites research of Spiranthes sinensis fine cultivar.
Key words Spiranthes sinensis; Regeneration system; Induction
基金项目 黑龙江中医药大学校基金（200710）黑龙江中医药大学校基金（201004）；黑龙江中医药大学优秀创新人才支持计划（2012RCQ13）。
作者简介
李慧玲（1979-），女，黑龙江北安人，硕士，讲师，从事环境微生物和生物药物研究。*通讯作者，博士，副教授，从事生物制药研究。
收稿日期 20140526
绶草（Spiranthes sinensis）属于兰科绶草属植物，别名盘龙参、龙抱柱、猪鞭草等，原国家林业部颁布的《野生植物保护名录》中将其列为二级保护植物，现已列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》［1］。绶草生长于海拔400~3 200 m的山坡林下或草地，广泛分布于我国各省区。绶草根或全草入药，具有滋阴益气、补肾壮阳、凉血解毒、润肺止咳、消炎解毒、强筋骨、祛风湿之功效。用于病后气血两虚、少气无力、阴虚内热、神经衰弱、肺结核咯血、小儿季热、糖尿病、遗精、头晕、失眠等症状［2］。
绶草中已经报道分离出多种化合物：黄酮类化合物spirathetinⅠ、阿魏酸酯如阿魏酸二十八醇酯(octacosylferulate)、二氢菲类衍生物和甾醇类等［3-5］。其中阿魏酸二十八醇酯已被证实具有抗肿瘤的作用［3］，二氢菲类衍生物可能具抗乙肝病毒和抗SARS病毒的作用［6］。由于绶草植株瘦小、野生资源较少、有效成分很难提取和富集，这些都限制绶草药用价值的进一步开发。因此，建立绶草高频再生体系，对其优良品种的改良和次级代谢产物的研究具有重要意义。
1材料与方法
1.1材料
以黑龙江镜泊湖绶草为材料，取其花序轴为外植体。
1.2 方法
1.2.1
外植体消毒和预培养。将花序轴剪去小苞叶后用流水冲洗15 min，然后用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗4~5次。利用0.1%的氯化汞消毒3、5、7和10 min，用无菌水冲洗4~5次，将花序轴剪成1~2 cm小段接种于MS培养基中预培养。每个处理接种30个外植体，培养25 d，统计污染率、死亡率和成活率。
1.2.2
外植体的诱导培养。将预培养后生长良好的外植体接种于诱导培养基，诱导培养基以MS为基本培养基，添加不同浓度的6BA（0.2、0.6、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L），每种培养基接种30个外植体。
1.2.3
诱导芽的增殖培养。将诱导产生的芽接种于增殖培养基，增殖培养基以MS为基本培养基，添加不同浓度的6BA（0.6、1.0、1.5、3.0 mg/L）和IAA（0、0.2、0.4、0.6 mg/L）。每种培养基接种30个诱导芽。
1.2.4
诱导芽的生根培养。
将2 cm以上的芽接种于生根培养基中，以1/2 MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L），每种培养基接种30个芽。
1.3 培养条件
培养基添加蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，pH值为5.8，培养温度25 ℃，光照2 000 lx，每天12 h光照/12 h黑暗。
2 结果与分析
2.1 不同消毒方法对预培养的影响
外植体培养25 d后，消毒结果如表1所示，0.1%的氯化汞消毒效果随灭菌时间的增加而加强，外植体消毒10 min污染率为0，消毒7 min外植体出现枯死，消毒10 min枯死数量明显增加。鉴于外植体在消毒7 min时，污染和死亡较少，成活率也较高，所以0.1%氯化汞消毒7 min效果较好。
2.2 最佳诱导培养基的选择
外植体接种于诱导培养基15~18 d后，诱导芽生长情况如表2所示，6BA浓度在0.2 mg/L时没有分化芽；当浓度达到0.6 mg/L时开始分化芽，但是数量较少；随着6BA浓度的升高芽诱导率增加，当6BA浓度达到2.0 mg/L时芽诱导率达83.3%。因此外植体接种于培养基MS+6BA2.0最适宜芽的诱导。
表1 外植体的消毒处理
消毒时间∥min 接种数∥个 污染率∥%死亡率∥%成活率∥%
3 30 75 0 25
5 30 34 0 66
7 30 10 13 77
10 30 0 48 52
表2 外植体的芽诱导率
6BA浓度∥mg/L 接种数∥个 形成芽∥个芽诱导率∥%
0.2 30 0 0
0.6 30 2 6.7
1.0 30 15 50
1.5 30 18 60
2.0 30 25 83.3
2.3 最佳增殖培养基的选择
诱导芽在增殖培养基中生长4~5周后的芽增殖倍数结果见表3。表3表明，6BA浓度为1.5 mg/L时芽的增殖倍数高于6BA其他试验组，培养基中添加1.5 mg/L的6BA和0.4 mg/L的IAA时芽增殖倍数最高，因此最佳增殖培养基是MS+6BA1.5+IAA0.4。
表3 不同培养基的芽增殖倍数
IAA浓度mg/L 6BA浓度∥mg/L
0.6 1.0 1.5 3.0
0 2.4 2.7 3.3 1.2
0.2 1.7 2.9 4.6 1.5
0.4 1.3 3.2 4.7 1.8
0.6 1.1 2.1 4.1 2.3
2.4 最佳诱导生根培养基的选择
增殖后的芽转入生根培养基中培养15~17 d开始生根，3周以后观察生根情况。结果表明，NAA浓度是1.5 mg/L时生根率较高，所以最佳生根培养基是1/2MS+NAA1.5。
2.5 炼苗和移栽
组培苗生长到4~6 cm时，生根3~4条进行炼苗，打开培养瓶盖2~3 d，取出试管苗用水冲洗干净，洗去根部残留的培养基，移栽到草炭与蛭石（2∶1）中，注意保持适宜的湿度和遮阴，每周喷施1次MS培养基中的大量元素。经过30 d左右，当幼苗粗壮、挺拔、根系发达后移栽到土壤中。
3讨论
绶草属于兰科植物，在组织培养过程中经常会出现染菌、褐化等现象，究其原因主要与品种、取材部位和取材时间、外植体大小及伤害程度有关［7］。所以，在培养过程中需要严格遵照无菌操作规程，降低污染率。
6BA是细胞分裂素，主要作用是促进细胞分裂和诱导芽的分化，所以诱导芽的生成经常在培养基中添加6BA。NAA是生长素，可以诱导生根，效果较好，所以该研究利用NAA诱导生根达到了预期目的。该研究表明，进行绶草组织培养时，最适诱导培养基为MS+6BA2.0，最适增殖培养基为MS+6BA1.5+IAA0.4，最适生根培养基为1/2MS+NAA1.5。
参考文献
［1］ 国家环境保护总局.中国珍稀濒危保护植物名录(第一册)［M］.北京:中国科学院植物研究所，1987.
［2］《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海:上海科学技术出版社，1999：7916．
［3］ LIN Y L，HUANG R L，DON M J，et al.Dihydrophenanthrenes from Spiranthes sinensis［J］.Journal of Natural Products，2000，63(12):1608-1610.
［4］ LIN Y L，WANG W Y，KUO Y H.Homocyclotirucallane and two dihydrophenanthrenes from Spiranthes sinensis［J］.Chemical &Pharmaceutical Bulletin，2001，49(9):1098-1101.
［5］ PENG J Y，HAN X，XU L N，et al.Two new prenylated coumarins from Spiranthes sinensis (Pers.) Ames［J］.Journal of Asian Natural Products Research，2008，10(3): 256-259.
［6］ LINY L,CHEN W P，ABDULGAFOR D M.Dihydro phenanthrenenes from Bletilla formosana［J］.Chem Pharm Bul，2005，53 (9):1111-1113.
［7］ 陈少珍，卜朝阳，闭志强，等.兰花组织培养中常见问题及解决方法［J］.广西农业科学，2006，37(1):72-74.