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[摘要]目的探究多重连接探针扩增技术（MLPA）在产前诊断性染色体嵌合体的价值。方法收集2015年6月～2016年6月东莞市妇幼保健院产前诊断中心经核型分析或MLPA P095非整倍体检测试剂盒检测发现的性染色体嵌合体病例作为研究对象，共11例。比较这两种方法的检测结果，并用荧光原位杂交（FISH）验证性染色体嵌合体的真实性。结果MLPA结果显示，11例标本中，有9例标本（病例9至病例17）MLPA与核型分析结果均是阳性，其中8例（病例9至病例16）两种结果一致，1例（病例17）结果有差异。有1例（病例18）MLPA检测结果为嵌合体，而核型分析正常，有1例（病例19）核型分析发现嵌合体，而MLPA检测结果正常。FISH检测：除病例16外，其余病例均为真性嵌合体。MLPA、核型分析诊断性染色体嵌合体的灵敏度为90%，符合率为81.82%。结论MLPA对于产前诊断陛染色体嵌合体具有重要意义。
[关键词]多重连接探针扩增技术（MLPA）；核型分析；荧光原位杂交（FISH）；产前诊断；性染色体嵌合体
[中图分类号]R714.5 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2017）18-101-03
当染色体嵌合体发生在性染色体上时，就称之为性染色体嵌合体。性染色体嵌合体属于染色体非整倍体异常中的一种，其中嵌合体可以是染色体数目的异常、染色体结构的异常或者是同时伴有染色体数目和结构的异常改变。这种染色体的异常变化会导致相应的患儿可能表现出生殖器模糊、性腺的发育不完善及患性腺肿瘤的危险性增加等，给患儿和其家庭带来严重的经济和精神压力。因此，做好性染色体嵌合体的产前诊断就显得尤为重要。目前常用的检测方法是培养羊水细胞来做染色体核型分析，但此类方法耗时长，并且操作繁琐，因此我们考虑应用MLPA P095非整倍体检测试剂盒进行产前诊断，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
收集2015年6月～2016年6月东莞市妇幼保健院产前诊断中心经核型分析或MLPA P095非整倍体检测试剂盒检测发现的性染色体嵌合体病例作为研究对象，共11例。其中孕妇的年龄为21～37岁，平均为（28.3±3.4）岁；孕周为1～30周，平均为（21.00±4.40）周。本研究已经我院伦理委员会批准，所有孕妇均对本研究知情同意并签署知情同意书。
1.2检测方法
DNA的提取：取羊水1.5mL左右，离心后弃上清，加入GB缓冲液、蛋白酶等，混合后培育十分鐘。加入无水乙醇，常温下放3min后离心，将混合后获得的液体移置吸附柱，离心后弃上清，再加入GD缓冲液、PW缓冲液等，离心后弃上清。离心，弃上清，在常温下放置数分钟。把CR2移置洁净离心管，加入TB后在室内放置5min，离心。应用天根生化科技有限公司生产的微量样品基因组DNA提取试剂盒（DP316）提取羊水或者脐带血标本中基因组DNA。应用荷兰MRC-Holland公司生产的SALSA MLPA P095 Kit染色体非整倍体检测试剂盒来进行靶序列DNA杂交、连接及PCR扩增，形成PCR产物。将产物通过毛细管电泳分离得到数据，应用Genemapper4.02分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。通过贴壁细胞培养法培养羊水细胞，制片，分析染色体核型来进行染色体核型分析的检测。采用雅培公司生产的FISH探针来进行FISH检测，经过探针标记、杂交、染色体显带、荧光显微镜检测和结果分析而得出检测结果。
1.3观察指标
分别计算染色体核型分析和MLPA技术的诊断符合率和灵敏度。诊断符合率=真阳性+真阴性/总例数，诊断的灵敏度=真阳性/真阳性+假阴性。在两个及其以上原位培养物中均最少出现两种及其以上的异常染色体核型，异常核型均在两个及两个以上的细胞集落中出现，且核型相同，则可认为是真性嵌合体。
2结果
2.1三种检测方法结果的比较
在11例性染色体嵌合体标本中，有9例标本（病例9至病例17）MLPA与核型分析结果均是阳性，其中8例（病例9至病例16）两种结果一致，1例（病例17）结果有差异。此外，有1例（病例18）MLPA检测结果为嵌合体，而核型分析正常，有1例（病例19）核型分析发现嵌合体，而MLPA检测结果正常。FISH检测显示，结果不一致的3例病例（病例17、病例18和病例19）的未培养羊水细胞经X染色体探针荧光原位杂交技术分析，证实均为真性嵌合体，而结果一致的8例病例中，病例16的染色体核型正常，其余病例均为真性嵌合体。染色体核型分析、MLPA、Fish检测的结果分别见表1～3。
2.2 MLPA和核型分析诊断性染色体嵌合体的符合率和灵敏度
MLPA诊断性染色体嵌合体的灵敏度为90%，符合率为81.82%。染色体核型分析诊断性染色体嵌合体的灵敏度也为90%，符合率为81.82%。
3讨论
目前，产前诊断染色体异常的方法主要是染色体核型分析。这种检测手段也具有一定的缺点，包括从采集标本到得出结果所需要的时间长、对技术人员的专业水平要求高、细胞培养的过程容易受到污染等。因此，临床工作中迫切需要新的诊断技术来弥补染色体核型分析的缺陷。随着分子生物学技术的发展，QF-PCR、MLPA等技术涌现出来，比较适合在临床检测中使用。
MLPA技术，也就是多重连接探针扩增技术，是近些年发展起来的可以针对被检测DNA序列进行半定量和定性分析的一种技术，具有高效、特异、快速、成本低及简便的优点。MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，而每个探针都包含一段引物和一段特异性序列。而两个寡核苷酸片段可以与靶序列DNA进行杂交互补，经连接酶连接，PCR扩增，通过毛细管电泳分离扩增产物后分析整理数据而得出结果。这种方法同QF-PCR相比，消除了由于引物的类型不同而引起的扩增效率并不相同所造成的误差，因此准确性更高。
在本研究中，11例标本中，有9例标本（病例9至病例17）MLPA与核型分析结果均是阳性，其中8例（病例9至病例16）两种结果一致，1例（病例17）结果有差异。此外，有1例（病例18）MLPA检测结果为嵌合体，而核型分析正常，有1例（病例19）核型分析发现嵌合体，而MLPA检测结果正常。FISH检测：除病例16外，其余病例均为真性嵌合体。MLPA、核型分析诊断性染色体嵌合体的灵敏度为90%，符合率为81.82%。我们可以发现，同染色体核型分析检测的结果相比，MLPA技术与其在诊断性染色体嵌合体时具有相同的诊断符合率和灵敏度。这可能与MLPA技术通过探针的应用，可以将不同染色体所占数目的比例变为杂交探针数目的比例，并且通过PCR技术，将这种比例进行了数倍的放大，因此对于染色体异常的诊断准确性比较高有关。由于性染色体嵌合体的发病率较低，本研究中所选用的病例也较少，尤其是诊断结果为阴性的病例，因此并未给出相应特异度的相关计算。而且，MLPA的应用也具有一些限制性，包括并不能检测染色体的平衡易位、检测样本易受污染等。
综上所述，同染色体核型分析方法相比，MLPA技术对于产前性染色体嵌合体的诊断也具较高的诊断灵敏性和诊断符合率，值得在产前性染色体嵌合体的诊断中推广应用。
[关键词]多重连接探针扩增技术（MLPA）；核型分析；荧光原位杂交（FISH）；产前诊断；性染色体嵌合体
[中图分类号]R714.5 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2017）18-101-03
当染色体嵌合体发生在性染色体上时，就称之为性染色体嵌合体。性染色体嵌合体属于染色体非整倍体异常中的一种，其中嵌合体可以是染色体数目的异常、染色体结构的异常或者是同时伴有染色体数目和结构的异常改变。这种染色体的异常变化会导致相应的患儿可能表现出生殖器模糊、性腺的发育不完善及患性腺肿瘤的危险性增加等，给患儿和其家庭带来严重的经济和精神压力。因此，做好性染色体嵌合体的产前诊断就显得尤为重要。目前常用的检测方法是培养羊水细胞来做染色体核型分析，但此类方法耗时长，并且操作繁琐，因此我们考虑应用MLPA P095非整倍体检测试剂盒进行产前诊断，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
收集2015年6月～2016年6月东莞市妇幼保健院产前诊断中心经核型分析或MLPA P095非整倍体检测试剂盒检测发现的性染色体嵌合体病例作为研究对象，共11例。其中孕妇的年龄为21～37岁，平均为（28.3±3.4）岁；孕周为1～30周，平均为（21.00±4.40）周。本研究已经我院伦理委员会批准，所有孕妇均对本研究知情同意并签署知情同意书。
1.2检测方法
DNA的提取：取羊水1.5mL左右，离心后弃上清，加入GB缓冲液、蛋白酶等，混合后培育十分鐘。加入无水乙醇，常温下放3min后离心，将混合后获得的液体移置吸附柱，离心后弃上清，再加入GD缓冲液、PW缓冲液等，离心后弃上清。离心，弃上清，在常温下放置数分钟。把CR2移置洁净离心管，加入TB后在室内放置5min，离心。应用天根生化科技有限公司生产的微量样品基因组DNA提取试剂盒（DP316）提取羊水或者脐带血标本中基因组DNA。应用荷兰MRC-Holland公司生产的SALSA MLPA P095 Kit染色体非整倍体检测试剂盒来进行靶序列DNA杂交、连接及PCR扩增，形成PCR产物。将产物通过毛细管电泳分离得到数据，应用Genemapper4.02分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。通过贴壁细胞培养法培养羊水细胞，制片，分析染色体核型来进行染色体核型分析的检测。采用雅培公司生产的FISH探针来进行FISH检测，经过探针标记、杂交、染色体显带、荧光显微镜检测和结果分析而得出检测结果。
1.3观察指标
分别计算染色体核型分析和MLPA技术的诊断符合率和灵敏度。诊断符合率=真阳性+真阴性/总例数，诊断的灵敏度=真阳性/真阳性+假阴性。在两个及其以上原位培养物中均最少出现两种及其以上的异常染色体核型，异常核型均在两个及两个以上的细胞集落中出现，且核型相同，则可认为是真性嵌合体。
2结果
2.1三种检测方法结果的比较
在11例性染色体嵌合体标本中，有9例标本（病例9至病例17）MLPA与核型分析结果均是阳性，其中8例（病例9至病例16）两种结果一致，1例（病例17）结果有差异。此外，有1例（病例18）MLPA检测结果为嵌合体，而核型分析正常，有1例（病例19）核型分析发现嵌合体，而MLPA检测结果正常。FISH检测显示，结果不一致的3例病例（病例17、病例18和病例19）的未培养羊水细胞经X染色体探针荧光原位杂交技术分析，证实均为真性嵌合体，而结果一致的8例病例中，病例16的染色体核型正常，其余病例均为真性嵌合体。染色体核型分析、MLPA、Fish检测的结果分别见表1～3。
2.2 MLPA和核型分析诊断性染色体嵌合体的符合率和灵敏度
MLPA诊断性染色体嵌合体的灵敏度为90%，符合率为81.82%。染色体核型分析诊断性染色体嵌合体的灵敏度也为90%，符合率为81.82%。
3讨论
目前，产前诊断染色体异常的方法主要是染色体核型分析。这种检测手段也具有一定的缺点，包括从采集标本到得出结果所需要的时间长、对技术人员的专业水平要求高、细胞培养的过程容易受到污染等。因此，临床工作中迫切需要新的诊断技术来弥补染色体核型分析的缺陷。随着分子生物学技术的发展，QF-PCR、MLPA等技术涌现出来，比较适合在临床检测中使用。
MLPA技术，也就是多重连接探针扩增技术，是近些年发展起来的可以针对被检测DNA序列进行半定量和定性分析的一种技术，具有高效、特异、快速、成本低及简便的优点。MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，而每个探针都包含一段引物和一段特异性序列。而两个寡核苷酸片段可以与靶序列DNA进行杂交互补，经连接酶连接，PCR扩增，通过毛细管电泳分离扩增产物后分析整理数据而得出结果。这种方法同QF-PCR相比，消除了由于引物的类型不同而引起的扩增效率并不相同所造成的误差，因此准确性更高。
在本研究中，11例标本中，有9例标本（病例9至病例17）MLPA与核型分析结果均是阳性，其中8例（病例9至病例16）两种结果一致，1例（病例17）结果有差异。此外，有1例（病例18）MLPA检测结果为嵌合体，而核型分析正常，有1例（病例19）核型分析发现嵌合体，而MLPA检测结果正常。FISH检测：除病例16外，其余病例均为真性嵌合体。MLPA、核型分析诊断性染色体嵌合体的灵敏度为90%，符合率为81.82%。我们可以发现，同染色体核型分析检测的结果相比，MLPA技术与其在诊断性染色体嵌合体时具有相同的诊断符合率和灵敏度。这可能与MLPA技术通过探针的应用，可以将不同染色体所占数目的比例变为杂交探针数目的比例，并且通过PCR技术，将这种比例进行了数倍的放大，因此对于染色体异常的诊断准确性比较高有关。由于性染色体嵌合体的发病率较低，本研究中所选用的病例也较少，尤其是诊断结果为阴性的病例，因此并未给出相应特异度的相关计算。而且，MLPA的应用也具有一些限制性，包括并不能检测染色体的平衡易位、检测样本易受污染等。
综上所述，同染色体核型分析方法相比，MLPA技术对于产前性染色体嵌合体的诊断也具较高的诊断灵敏性和诊断符合率，值得在产前性染色体嵌合体的诊断中推广应用。