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摘要 [目的]选择副溶血弧菌噬菌体的适宜吸附剂，并研究其吸附和洗脱作用。[方法]比较了滑石粉+硅藻土（3∶1）、活性炭、蒙脱石、玻璃纤维4种吸附剂对副溶血弧菌噬菌体的吸附固定化效果以及洗脱效果。[结果]蒙脱石和玻璃纤维对噬菌体的吸附效果好。
通过单因素试验和正交试验研究蒙脱石用量、吸附时间、吸附液pH对噬菌体固定化的影响，结果发现当蒙脱石用量为0.5 g，吸附时间为1 h，吸附液pH为6.0时，吸附效果最佳。[结论]将副溶血弧菌噬菌体制成固定化制剂后分别作用于养殖动物和养殖水体，可以达到对养殖动物进行生物防治和改善水体环境的目的。
关键词 副溶血弧菌噬菌体；吸附；洗脱；蒙脱石
中图分类号 S94 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2017）13-0107-04
Selection of Adsorption Material for Vibrio parahaemolyticus Phage and Its Adsorption and Elution Effects
HU Die1，QIU De-quan2*
（1.Zhanjiang Tengfei Industrial Co.，Ltd.，Zhanjiang，Guangdong 524072；2.College of Fisheries，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524025）
Abstract [Objective] To select suitable adsorbent for Vibrio parahaemolyticus phage and study its adsorption and elution effects.[Method] The adsorption immobilization effect and elution effect of 4 kinds of adsorbents French chalk+diatomite（3：1），active carbon，montmorillonite，and fiberglas）on V.parahaemolyticus phage were compared.[Result] Montmorillonite and fiberglas had better adsorbability to phage.The effects of montmorillonite quantity，adsorption time and pH of eluant on the phage immobilization were studied by single factor test and orthogonal test，and the results showed that the adsorption effect was the best when the quantity of montmorillonite was 0.5 g，the adsorption time was 1 h，pH of eluant was 6.[Conclusion] After V.parahaemolyticus phage was prepared to immobilized preparation，it was used in aquaculture animal and water，to achieve the purpose of biological control and improvement of aquatic environment.
Key words Vibrio parahaemolyticus phage；Adsorption；Elution；Montmorillonite
随着海水养殖的发展，弧菌病已成为养殖对虾的主要细菌病害之一。其中，副溶血弧菌主要感染对象是对虾、海水鱼类等，感染蟹类、贝类会引起大量死亡[1]。由该菌引起的食物中毒具有起病急、发病率高的特点[2]。治疗的常用方法有抗菌药物防治、免疫防治、生物防治等。抗菌药物主要使用抗生素[3]，但使用抗生素存在着药物残留、对人体健康造成危害、对环境产生污染等危害，并伴随着耐药菌的大量出现。疫苗免疫接种是免疫防治的主要方式，采用口服 、浸泡、注射、喷雾等措施来提高机体的免疫力[4]，但制作复杂，周期长和成本高，不合适大范围养殖规模。噬菌体是感染细菌和放线菌的病毒，作为生物防治的主要手段[5]，将改变单纯用抗生素治疗细菌性疾病的传统观念，开辟一个全新的治疗领域，将细菌性疾病的治疗推向一个新阶段。固定化微生物技术是20世纪60年代由生物化工中的固定化酶技术发展起来的生物处理技术[6]。吸附法在固定化微生物技术中最为常用，利用微生物具有的可吸附到固体物质表面或其他细胞表面的能力，将微生物吸附在附加剂表面的方法，是一种非常廉价和有效的微生物固定化方法，实现简单，操作容易，反应条件温和，对微生物活性影响小，载体可重复使用。多孔陶粒[7]、活性炭[8]、沸石[9]、石英砂[10]、硅藻土[11]等吸附剂能将微生物吸附在表面，从而使其固定化。笔者对副溶血弧菌噬菌体进行固定化，以期制得可以作用于水体的固定化制剂。然而，由于噬菌体的个体较小，直接将噬菌體包埋成固定化小球的效果并不好。因此，笔者先将噬菌体进行吸附法固定，再将吸附过后的物质进行包埋，以制取可以作用于水体的固定化小球。
1 材料与方法
1.1 菌株 副溶血弧菌（Vivrio parahaemolyticus）菌株，广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室分离自患红体病凡纳滨对虾，经鉴定为副溶血弧菌[12]。 副溶血弧菌噬菌体（Vivrio parahaemolyticus phage I，简写为PI），由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室分离并保存[13]。
1.2 试验药品及培养基
1.2.1 试验药品。
滑石粉、硅藻土、活性炭、玻璃纤维、牛肉浸膏均为分析纯；蒙脱石散（商品名思密达Smecta，法国博福）益普生制药有限公司。
1.2.2 培养基。
上层琼脂半固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂15 g，补陈海水至1 000 mL，pH为7.4～7.8，混匀，高压蒸气灭菌，121 ℃，20 min。
下层琼脂固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂7 g，补陈海水至1 000 mL，混匀，调整pH至7.4-7.8，高压蒸气灭菌，121 ℃，20 min。
1.3 副溶血弧菌液和噬菌体悬液的制备
将一定量的副溶血弧菌菌液接种LB 平板，30 ℃条件下培养约24 h，用无菌海水洗下，并用血球计数板计数，计算副溶血弧菌液浓度。副溶血弧菌噬菌体PI 的制备和纯化参照《分子克隆实验指南》[14]。副溶血弧菌菌液为2×107 CFU/mL，副溶血弧菌噬菌体悬液为1.0×1013 PFU/mL，试验时稀释使用。
1.4 4种吸附剂吸附和洗脱效果试验 选择4种吸附剂：滑石粉+硅藻土（3∶1）、活性炭、蒙脱石、玻璃纤维。
吸附剂的量除了滑石粉2.7 g+硅藻土0.9 g外，其余都为3 g ，分别加入20 mL 1.1×1010、4.6×109、1.1×108、4.7×107和5.8×106 PFU/mL的噬菌体（pH 4.0），搅拌后吸附30 min，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，再向沉淀中加入10 mL灭菌海水（pH 4.0），洗脱30 min后3 000 r/min离心10 min，回收上清液，合并2次上清液。再向沉淀中加入20 mL的3%的牛肉浸膏（pH 10.0），洗脱30 min，3 000 r/min离心10 min，收集洗脱液。每组做3个平行，采用双平板法测定上清液和洗脱液的噬菌体量（噬菌体效价）。洗脱效果用回收率表述，计算公式如下：
1.5 考察蒙脱石吸附效果的单因素试验及正交试验
向吸附剂蒙脱石（用量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、20、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 g）中加入噬菌体液20 mL（pH 4.0，浓度4.6×109 PFU/mL），吸附30 min后，3 000 r/min离心10 min，回收上清液；将离心后的蒙脱石置于100 mL的灭菌海水（pH 4.0）中搅拌均匀，洗脱30 min，3 000 r/min离心10 min，回收洗脱液。采用双平板法测定上清液和洗脱液的噬菌体量。通过改变蒙脱石的量、吸附时间和吸附pH等参数进行考察蒙脱石吸附效果的单因素试验及正交试验。试验时每组做3个平行。
1.6 数据统计与分析
使用 SPSS 17.0 软件分析样品之间指标的差异。差异显著水平α= 0.05，结果均以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 4种吸附剂的吸附效果
由表1可知，4种吸附剂的吸附率从高到低依次为：活性炭、蒙脱石、滑石粉+硅藻土、玻璃纤维。由表2可知，玻璃纤维的洗脱效果最好，洗脱率达91666 7%，吸附噬菌体效果不好，回收率仅21.818 2%；蒙脱石的洗脱效果次之，活性炭最差。因此，选择蒙脱石作为吸附材料进行进一步研究。
2.2 蒙脱石的吸附效果
2.2.1 蒙脱石用量对吸附效果的影响。
从图1可以看出，随着蒙脱石用量的逐渐增加，其洗脱液噬菌体量也逐渐增大，当蒙脱石用量增至0.5 g时，其洗脱液噬菌体量达到最大值，为5.1×108 PFU/mL，同时其上清液噬菌体量为2.2×107 PFU/mL，当蒙脱石用量继续增大时，洗脱液噬菌体量则不断降低，因此蒙脱石最佳用量为0.5 g。
2.2.2 吸附时间对吸附效果的影响。
从图2可以看出，当吸附时间为0.5 h时洗脱液噬菌体量为6.7×108 PFU/mL，此后随着吸附时间的增加，洗脱液噬菌体量不断减少；当吸附时间为2 h 时，洗脱液噬菌体量达到最大值（7.8×108 PFU/mL）。洗脱液噬菌体量随着吸附时间的不断延长而减小。由此可见，当吸附时间为2 h时吸附效果最佳。
2.2.3 吸附液pH对吸附效果的影响。
从图3可以看出，当吸附液pH为6.0时，洗脱液噬菌体量达到最大值（6.0×108 PFU/mL），此时吸附效果较好。
根据以前的研究成果[13]可知，此噬菌体的最适pH范围为7.5～8.5，其存活的pH范围较宽，除了pH 9.0外，在pH 6.0～11.0时均比较稳定，其成活率在80%以上。当pH在8.0左右时最为稳定，存活率最高，活性最强。对pH 4.0以下的酸性环境耐受性较差，对存活率有明显影响。
该试验结果表明，当吸附液的pH为6.0时，洗脱液噬菌体量为6.0×108 PFU/mL，与吸附液的pH为8.0时的洗脱液中噬菌体的量（5.9×108 PFU/mL）基本相同，究其原因可能与此噬菌体的pH耐受有关。
2.3 正交试验
通过以上单因素试验，在正交試验中选择3个因素：吸附液pH、吸附时间、蒙脱石用量。对每个因素分别设置3个水平，进行正交试验。正交试验因素与水平设计如表3所示。正交试验结果见表4。
由表4可知，根据各因素极差大小可知，各因素对吸附效果的影响从大到小依次为吸附液pH、蒙脱石用量和吸附时间。当吸附液pH为6.0、吸附时间为1 h、蒙脱石用量为0.5 g时，综合得分最高，吸附效果最好。 3 结论与讨论
3.1 吸附材料的选择
笔者选取滑石粉+硅藻土（3∶1）、活性炭、蒙脱石和玻璃纤维作为吸附剂，进行噬菌体的吸附法固定。滑石粉-硅藻土水体病毒浓缩方法是张楚瑜等[15]在1983年发展起来的，该方法测得的病毒回收率为54.2%～98.2%，平均回收率为83.5%。赵淑敏等[16]用滑石粉-硅藻土浓缩法测得病毒回收率为35.48%～50.12%，发现试验操作时间长、结果稳定性差、需设备复杂。该试验采用滑石粉-硅藻土吸附噬菌体所得到的回收率远远低于张楚瑜等[15]和赵淑敏等[16]测得的回收率，故排除滑石粉-硅藻土这种吸附材料。Jothikumar等[17]用顆粒状活性炭（GAC）填充的滤柱成功吸附饮用水样中的肠道病毒、戊型肝炎病毒（HEV）和轮状病毒，结果表明活性炭对不同浓度噬菌体的吸附作用的回收率一直较低，故也予以排除。
郑耀通等[18]开发并优化钠化蒙脱石吸附病毒浓缩方法，对肠道病毒 PV1、大肠杆菌噬菌体、植物病毒 TMV 在3种不同水体环境中的回收率分别为90.5%、88.3%、94.1%。樊志成等[19]研究表明蒙脱石原料药制剂对大肠杆菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄糖球菌和轮状病毒以及胆盐都有较好的吸附作用，对细菌毒素也有固定作用。该试验中蒙脱石吸附噬菌体的回收率（87.15%）与郑耀通等[18]研究结果相差不大，所以可以考虑蒙脱石作为吸附材料。
玻璃纤维对噬菌体的吸附效果较好，回收率也较高，故也可考虑将其作为一种吸附材料。该试验结果表明，由于吸附同样多的噬菌体，需要玻璃纤维的量远远大于蒙脱石的量，且玻璃纤维操作较为繁琐，因而，从成本及可行性来看，选取蒙脱石作为后续试验的吸附剂。
3.2 蒙脱石的吸附作用
该试验选取吸附液pH、吸附时间及吸附剂用量3个因素对蒙脱石吸附噬菌体进行了研究。结果表明，随着蒙脱石用量的逐渐增加，其洗脱液噬菌体量逐渐增大，当蒙脱石用量增至0.5 g时，其洗脱液噬菌体量达到最大值；当蒙脱石用量继续增加时，洗脱液噬菌体量不断减小，因而确定蒙脱石最佳用量为0.5 g。在其他条件确定的情况下，当吸附时间为0.5 h时洗脱液噬菌体量较大，此后随着吸附时间的增加，洗脱液噬菌体量不断减少；当吸附时间为2 h 时，洗脱液噬菌体量达到最大值，此后随着吸附时间的不断延长，洗脱液噬菌体量不断减小，因而，当吸附时间为2 h时，吸附效果最佳。该试验结果与韩秀山等[20] 关于Bt原毒素在蒙脱石上的吸附0.5～1.0 h就能达到平衡的结论相差不大。该试验结果表明，在其他条件一定的情况下，当吸附液pH为6.0时洗脱液噬菌体量达到最大值，此时吸附效果较好。熊正为等[21]在蒙脱石吸附铀试验中发现，当溶液pH为5.0～6.0时，蒙脱石对铀的吸附率最大，与该试验结果相一致。此噬菌体的最适pH为7.5～8.5，其存活的pH范围较宽，除pH 9.0外，当pH为6.0～11.0时均比较稳定，成活率在80%以上，pH 8.0左右时最稳定，存活率最高，活性最强，对pH 4.0以下的酸性环境的耐受性较差，对存活率有明显影
响[13]。该试验结果表明，当吸附液的pH为6.0和8.0时，洗脱液噬菌体量基本相同，究其原因可能与此噬菌体的pH耐受有关。
该试验选取吸附液pH、吸附时间和蒙脱石用量3因素进行正交试验，结果表明，当蒙脱石用量为0.5 g、吸附时间为1 h、吸附液pH为6.0时，蒙脱石对噬菌体的吸附效果最佳。
参考文献
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通过单因素试验和正交试验研究蒙脱石用量、吸附时间、吸附液pH对噬菌体固定化的影响，结果发现当蒙脱石用量为0.5 g，吸附时间为1 h，吸附液pH为6.0时，吸附效果最佳。[结论]将副溶血弧菌噬菌体制成固定化制剂后分别作用于养殖动物和养殖水体，可以达到对养殖动物进行生物防治和改善水体环境的目的。
关键词 副溶血弧菌噬菌体；吸附；洗脱；蒙脱石
中图分类号 S94 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2017）13-0107-04
Selection of Adsorption Material for Vibrio parahaemolyticus Phage and Its Adsorption and Elution Effects
HU Die1，QIU De-quan2*
（1.Zhanjiang Tengfei Industrial Co.，Ltd.，Zhanjiang，Guangdong 524072；2.College of Fisheries，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524025）
Abstract [Objective] To select suitable adsorbent for Vibrio parahaemolyticus phage and study its adsorption and elution effects.[Method] The adsorption immobilization effect and elution effect of 4 kinds of adsorbents French chalk+diatomite（3：1），active carbon，montmorillonite，and fiberglas）on V.parahaemolyticus phage were compared.[Result] Montmorillonite and fiberglas had better adsorbability to phage.The effects of montmorillonite quantity，adsorption time and pH of eluant on the phage immobilization were studied by single factor test and orthogonal test，and the results showed that the adsorption effect was the best when the quantity of montmorillonite was 0.5 g，the adsorption time was 1 h，pH of eluant was 6.[Conclusion] After V.parahaemolyticus phage was prepared to immobilized preparation，it was used in aquaculture animal and water，to achieve the purpose of biological control and improvement of aquatic environment.
Key words Vibrio parahaemolyticus phage；Adsorption；Elution；Montmorillonite
随着海水养殖的发展，弧菌病已成为养殖对虾的主要细菌病害之一。其中，副溶血弧菌主要感染对象是对虾、海水鱼类等，感染蟹类、贝类会引起大量死亡[1]。由该菌引起的食物中毒具有起病急、发病率高的特点[2]。治疗的常用方法有抗菌药物防治、免疫防治、生物防治等。抗菌药物主要使用抗生素[3]，但使用抗生素存在着药物残留、对人体健康造成危害、对环境产生污染等危害，并伴随着耐药菌的大量出现。疫苗免疫接种是免疫防治的主要方式，采用口服 、浸泡、注射、喷雾等措施来提高机体的免疫力[4]，但制作复杂，周期长和成本高，不合适大范围养殖规模。噬菌体是感染细菌和放线菌的病毒，作为生物防治的主要手段[5]，将改变单纯用抗生素治疗细菌性疾病的传统观念，开辟一个全新的治疗领域，将细菌性疾病的治疗推向一个新阶段。固定化微生物技术是20世纪60年代由生物化工中的固定化酶技术发展起来的生物处理技术[6]。吸附法在固定化微生物技术中最为常用，利用微生物具有的可吸附到固体物质表面或其他细胞表面的能力，将微生物吸附在附加剂表面的方法，是一种非常廉价和有效的微生物固定化方法，实现简单，操作容易，反应条件温和，对微生物活性影响小，载体可重复使用。多孔陶粒[7]、活性炭[8]、沸石[9]、石英砂[10]、硅藻土[11]等吸附剂能将微生物吸附在表面，从而使其固定化。笔者对副溶血弧菌噬菌体进行固定化，以期制得可以作用于水体的固定化制剂。然而，由于噬菌体的个体较小，直接将噬菌體包埋成固定化小球的效果并不好。因此，笔者先将噬菌体进行吸附法固定，再将吸附过后的物质进行包埋，以制取可以作用于水体的固定化小球。
1 材料与方法
1.1 菌株 副溶血弧菌（Vivrio parahaemolyticus）菌株，广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室分离自患红体病凡纳滨对虾，经鉴定为副溶血弧菌[12]。 副溶血弧菌噬菌体（Vivrio parahaemolyticus phage I，简写为PI），由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室分离并保存[13]。
1.2 试验药品及培养基
1.2.1 试验药品。
滑石粉、硅藻土、活性炭、玻璃纤维、牛肉浸膏均为分析纯；蒙脱石散（商品名思密达Smecta，法国博福）益普生制药有限公司。
1.2.2 培养基。
上层琼脂半固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂15 g，补陈海水至1 000 mL，pH为7.4～7.8，混匀，高压蒸气灭菌，121 ℃，20 min。
下层琼脂固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，琼脂7 g，补陈海水至1 000 mL，混匀，调整pH至7.4-7.8，高压蒸气灭菌，121 ℃，20 min。
1.3 副溶血弧菌液和噬菌体悬液的制备
将一定量的副溶血弧菌菌液接种LB 平板，30 ℃条件下培养约24 h，用无菌海水洗下，并用血球计数板计数，计算副溶血弧菌液浓度。副溶血弧菌噬菌体PI 的制备和纯化参照《分子克隆实验指南》[14]。副溶血弧菌菌液为2×107 CFU/mL，副溶血弧菌噬菌体悬液为1.0×1013 PFU/mL，试验时稀释使用。
1.4 4种吸附剂吸附和洗脱效果试验 选择4种吸附剂：滑石粉+硅藻土（3∶1）、活性炭、蒙脱石、玻璃纤维。
吸附剂的量除了滑石粉2.7 g+硅藻土0.9 g外，其余都为3 g ，分别加入20 mL 1.1×1010、4.6×109、1.1×108、4.7×107和5.8×106 PFU/mL的噬菌体（pH 4.0），搅拌后吸附30 min，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，再向沉淀中加入10 mL灭菌海水（pH 4.0），洗脱30 min后3 000 r/min离心10 min，回收上清液，合并2次上清液。再向沉淀中加入20 mL的3%的牛肉浸膏（pH 10.0），洗脱30 min，3 000 r/min离心10 min，收集洗脱液。每组做3个平行，采用双平板法测定上清液和洗脱液的噬菌体量（噬菌体效价）。洗脱效果用回收率表述，计算公式如下：
1.5 考察蒙脱石吸附效果的单因素试验及正交试验
向吸附剂蒙脱石（用量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、20、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 g）中加入噬菌体液20 mL（pH 4.0，浓度4.6×109 PFU/mL），吸附30 min后，3 000 r/min离心10 min，回收上清液；将离心后的蒙脱石置于100 mL的灭菌海水（pH 4.0）中搅拌均匀，洗脱30 min，3 000 r/min离心10 min，回收洗脱液。采用双平板法测定上清液和洗脱液的噬菌体量。通过改变蒙脱石的量、吸附时间和吸附pH等参数进行考察蒙脱石吸附效果的单因素试验及正交试验。试验时每组做3个平行。
1.6 数据统计与分析
使用 SPSS 17.0 软件分析样品之间指标的差异。差异显著水平α= 0.05，结果均以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 4种吸附剂的吸附效果
由表1可知，4种吸附剂的吸附率从高到低依次为：活性炭、蒙脱石、滑石粉+硅藻土、玻璃纤维。由表2可知，玻璃纤维的洗脱效果最好，洗脱率达91666 7%，吸附噬菌体效果不好，回收率仅21.818 2%；蒙脱石的洗脱效果次之，活性炭最差。因此，选择蒙脱石作为吸附材料进行进一步研究。
2.2 蒙脱石的吸附效果
2.2.1 蒙脱石用量对吸附效果的影响。
从图1可以看出，随着蒙脱石用量的逐渐增加，其洗脱液噬菌体量也逐渐增大，当蒙脱石用量增至0.5 g时，其洗脱液噬菌体量达到最大值，为5.1×108 PFU/mL，同时其上清液噬菌体量为2.2×107 PFU/mL，当蒙脱石用量继续增大时，洗脱液噬菌体量则不断降低，因此蒙脱石最佳用量为0.5 g。
2.2.2 吸附时间对吸附效果的影响。
从图2可以看出，当吸附时间为0.5 h时洗脱液噬菌体量为6.7×108 PFU/mL，此后随着吸附时间的增加，洗脱液噬菌体量不断减少；当吸附时间为2 h 时，洗脱液噬菌体量达到最大值（7.8×108 PFU/mL）。洗脱液噬菌体量随着吸附时间的不断延长而减小。由此可见，当吸附时间为2 h时吸附效果最佳。
2.2.3 吸附液pH对吸附效果的影响。
从图3可以看出，当吸附液pH为6.0时，洗脱液噬菌体量达到最大值（6.0×108 PFU/mL），此时吸附效果较好。
根据以前的研究成果[13]可知，此噬菌体的最适pH范围为7.5～8.5，其存活的pH范围较宽，除了pH 9.0外，在pH 6.0～11.0时均比较稳定，其成活率在80%以上。当pH在8.0左右时最为稳定，存活率最高，活性最强。对pH 4.0以下的酸性环境耐受性较差，对存活率有明显影响。
该试验结果表明，当吸附液的pH为6.0时，洗脱液噬菌体量为6.0×108 PFU/mL，与吸附液的pH为8.0时的洗脱液中噬菌体的量（5.9×108 PFU/mL）基本相同，究其原因可能与此噬菌体的pH耐受有关。
2.3 正交试验
通过以上单因素试验，在正交試验中选择3个因素：吸附液pH、吸附时间、蒙脱石用量。对每个因素分别设置3个水平，进行正交试验。正交试验因素与水平设计如表3所示。正交试验结果见表4。
由表4可知，根据各因素极差大小可知，各因素对吸附效果的影响从大到小依次为吸附液pH、蒙脱石用量和吸附时间。当吸附液pH为6.0、吸附时间为1 h、蒙脱石用量为0.5 g时，综合得分最高，吸附效果最好。 3 结论与讨论
3.1 吸附材料的选择
笔者选取滑石粉+硅藻土（3∶1）、活性炭、蒙脱石和玻璃纤维作为吸附剂，进行噬菌体的吸附法固定。滑石粉-硅藻土水体病毒浓缩方法是张楚瑜等[15]在1983年发展起来的，该方法测得的病毒回收率为54.2%～98.2%，平均回收率为83.5%。赵淑敏等[16]用滑石粉-硅藻土浓缩法测得病毒回收率为35.48%～50.12%，发现试验操作时间长、结果稳定性差、需设备复杂。该试验采用滑石粉-硅藻土吸附噬菌体所得到的回收率远远低于张楚瑜等[15]和赵淑敏等[16]测得的回收率，故排除滑石粉-硅藻土这种吸附材料。Jothikumar等[17]用顆粒状活性炭（GAC）填充的滤柱成功吸附饮用水样中的肠道病毒、戊型肝炎病毒（HEV）和轮状病毒，结果表明活性炭对不同浓度噬菌体的吸附作用的回收率一直较低，故也予以排除。
郑耀通等[18]开发并优化钠化蒙脱石吸附病毒浓缩方法，对肠道病毒 PV1、大肠杆菌噬菌体、植物病毒 TMV 在3种不同水体环境中的回收率分别为90.5%、88.3%、94.1%。樊志成等[19]研究表明蒙脱石原料药制剂对大肠杆菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄糖球菌和轮状病毒以及胆盐都有较好的吸附作用，对细菌毒素也有固定作用。该试验中蒙脱石吸附噬菌体的回收率（87.15%）与郑耀通等[18]研究结果相差不大，所以可以考虑蒙脱石作为吸附材料。
玻璃纤维对噬菌体的吸附效果较好，回收率也较高，故也可考虑将其作为一种吸附材料。该试验结果表明，由于吸附同样多的噬菌体，需要玻璃纤维的量远远大于蒙脱石的量，且玻璃纤维操作较为繁琐，因而，从成本及可行性来看，选取蒙脱石作为后续试验的吸附剂。
3.2 蒙脱石的吸附作用
该试验选取吸附液pH、吸附时间及吸附剂用量3个因素对蒙脱石吸附噬菌体进行了研究。结果表明，随着蒙脱石用量的逐渐增加，其洗脱液噬菌体量逐渐增大，当蒙脱石用量增至0.5 g时，其洗脱液噬菌体量达到最大值；当蒙脱石用量继续增加时，洗脱液噬菌体量不断减小，因而确定蒙脱石最佳用量为0.5 g。在其他条件确定的情况下，当吸附时间为0.5 h时洗脱液噬菌体量较大，此后随着吸附时间的增加，洗脱液噬菌体量不断减少；当吸附时间为2 h 时，洗脱液噬菌体量达到最大值，此后随着吸附时间的不断延长，洗脱液噬菌体量不断减小，因而，当吸附时间为2 h时，吸附效果最佳。该试验结果与韩秀山等[20] 关于Bt原毒素在蒙脱石上的吸附0.5～1.0 h就能达到平衡的结论相差不大。该试验结果表明，在其他条件一定的情况下，当吸附液pH为6.0时洗脱液噬菌体量达到最大值，此时吸附效果较好。熊正为等[21]在蒙脱石吸附铀试验中发现，当溶液pH为5.0～6.0时，蒙脱石对铀的吸附率最大，与该试验结果相一致。此噬菌体的最适pH为7.5～8.5，其存活的pH范围较宽，除pH 9.0外，当pH为6.0～11.0时均比较稳定，成活率在80%以上，pH 8.0左右时最稳定，存活率最高，活性最强，对pH 4.0以下的酸性环境的耐受性较差，对存活率有明显影
响[13]。该试验结果表明，当吸附液的pH为6.0和8.0时，洗脱液噬菌体量基本相同，究其原因可能与此噬菌体的pH耐受有关。
该试验选取吸附液pH、吸附时间和蒙脱石用量3因素进行正交试验，结果表明，当蒙脱石用量为0.5 g、吸附时间为1 h、吸附液pH为6.0时，蒙脱石对噬菌体的吸附效果最佳。
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