【摘 要】
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新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor,FcRn)能够特异性识别并跨越黏膜屏障转运IgG.为了确定猪(Sus scrofa)FcRn与IgG抗体Fc段CH2结构域的互作关系,本研究通过逆转录PCR技术克
【机 构】
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安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室,合肥230036
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新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor,FcRn)能够特异性识别并跨越黏膜屏障转运IgG.为了确定猪(Sus scrofa)FcRn与IgG抗体Fc段CH2结构域的互作关系,本研究通过逆转录PCR技术克隆获得猪IgG抗体Fc段CH2基因片段,并将其亚克隆至原核表达载体pEGX-4T-1,经异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导融合蛋白表达并通过谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)亲和柱纯化.同时将IgG CH2基因片段亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1,通过共转染确定IgG CH2与FcRn在非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)肾细胞(COS-7)中的细胞共定位,免疫共沉淀验证IgG CH2与FcRn的相互作用;进一步通过ELISA方法检测CH2与FcRn在不同pH值下的结合力.结果表明,克隆获得猪IgG CH2基因全长330 bp,编码110个氨基酸.诱导表达的融合蛋白GST-CH2相对分子量为38.4 kD,该蛋白在诱导菌体中以可溶性和包涵体两种形式存在.激光共聚焦观察显示,IgG CH2与FcRn共定位于细胞质中,具有共聚集现象.免疫共沉淀显示,通过标签蛋白GFP和Flag,在所有的共沉淀条带中,均能检测到对应的目的条带,说明IgG CH2能够结合FcRn.ELISA结果表明,IgG CH2与FcRn的结合呈现pH值依赖性.综上所述,本研究确定了FcRn与IgG抗体Fc段CH2结构域存在细胞共定位与互作关系,二者的结合具有pH依赖性,这为构建新的基于Fc的小型抗体融合蛋白提供了材料.
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