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摘 要：随着技术的不断发展，荧光定量PCR不仅实现了从定性到定量的飞跃，且同常规PCR相比，能够在同一溶液当中实现不同反应，且无须后处理，具有灵敏度高以及特异性强的特点。荧光定量PCR 技术不仅实现了PCR 从定性到定量检测的飞跃，实现了对DNA/RNA 模板的定量，而且与常规的PCR 相比，所有反应均在同一溶液中进行，不需任何后处理，具有特异性强、灵敏度高、有效解决PCR污染问题、能实现多重反应、自动化程度高、定量结果准确和重现性好等特点。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域，特别是近几年来在动物疫病的诊断中得到了广泛的应用。
关键词：实时荧光定量PCR;动物疫病;诊断
近年来，随着实时荧光定量PCR 技术日趋成熟，多重实时荧光定量PCR （MFQ-PCR）技术也得到进一步发展。多重实时荧光定量PCR 技术，即在同一个反应体系中，同时加入多对引物以及相应的不同荧光分子标记的探针或者荧光染料，一次反应对多个靶基因进行实时定量检测，大大提高了检测效率，这一技术优势使之在临床多种病原体混合感染的筛查上具有广阔的前景。近几年来实时荧光定量PCR 技术，特别是多重实时荧光定量PCR 技术在动物疫病的诊断中也得到了越来越广泛的应用。
一、实时荧光PCR技术在动物疫病诊断
近年来， 随着养牛业迅速发展，尤其奶牛饲养数量不断增多、国际贸易频繁、牛群流动广泛、疫病监测和控制不力等众多因素， 使得牛疫病尤其病毒性传染病旧病未除，新病不断出现和流行。
1.禽流感病毒检测。目前，禽流感已经在世界范围内分布，大部分都为隐性感染，没有特殊临床表现，仅仅有少数类型具有高致病以及传播迅速的特征。由于该病毒具有较为频繁的变异特征，且具有较多的血清类型，在国外，以往经常以鸡胚病毒分离方式进行病毒检测，不仅检测时间较长，且检测血清类型较多。目前，我国已有学者根据病毒型开发设计出具有特异、敏感特征的引物探针，建立出能够实现A型病毒的荧光PCR。
2.新城疫病毒检测。该病毒根据其致病能力的不同可以分为弱毒、中等毒以及强毒力型。在以往诊断中，同样需要以鸡胚病毒分离方式进行检测，所需时间相对较长。在我国建立的荧光PCR法不仅能够将弱新城疫病毒同中强毒力的新城疫病毒进行区分，且不会同常见病毒发生交叉反应，即具有较高的敏感性。通过SYBR技术对新城疫病毒在定量以及定性方面分别开展分析，最终通过融解曲线实现PCR的定性分析。通过荧光PCR在新城疫病毒检测当中的应用，不仅能够获得同鸡胚分离一致的实验结果，且能够证明该方式具有快速、安全、敏感以及特异性特点。
3.鸭乙肝病毒检测。通过SYBR PCR技术的应用对鸭乙肝病毒进行检验，经过检验发现，该技术是对DHBV进行检测的新方式，具有敏感、特异以及简便的特征。对鸭乙肝病毒核酸PCR技术进行了建立，并将其应用在鸭血清病毒核酸监测当中，在实现目标体内复制情况分析的基础上为鸭肝炎病毒在评价、发病机理以及抗病毒疗效预测方面提供了重要依据。
4.猪瘟病毒检测。目前，现有的常规方式很难对带毒猪、隐性感染猪以及弱毒免疫猪进行区分。在猪瘟病毒弱毒疫苗5端非编码区对一条荧光探针以及引物进行了设计，在同LC监测系统相结合的基础上对猪瘟兔化弱毒疫苗的监测方式进行了建立，不仅具有较高的灵敏度，且检测耗时较短，仅仅需要4h。而温国元等，则将5端非编码区作为扩增靶区进行试验，对Tapman探针以及两条引物进行设计，实现了荧光PCR检测方式的建立。该方式灵敏度更高，可以达到10拷贝/μl，具有较好的应用效果。
5.伪狂犬病毒。口蹄疫是一种对偶蹄动物具有强烈传染性的疾病，危害非常大，根据聚合酶3D基因片段以保守区域方式实现探针以及引物的设计，在扩增区当中，口蹄疫病毒A、C、O型序列相同，在将探针同引物共同应用的情况下实现荧光PCR方式的建立，建立的荧光PCR技术，则对传统技术中病毒鉴定准确性差、敏感性差以及用时较长的缺点进行了克服，在对环境污染、病毒扩散缺点积极避免的基础上应用在大批量样品检测当中。
6.炭疽芽孢杆菌检测。Makino等通過炭疽特异性引物实现EQ PCR检测，在该方式中，能够有效地实现空气中细菌芽孢的检测。通过荧光PCR技术的应用，在pXI1质粒上pag基因实现基因探针以及引物的设计，对具有定性、快速、定量以及准确特征的炭疽芽孢杆菌检测方式进行了建立，在pXO1上pag基因以及pXO2上cap基因作为特异引物，在以DNA进行嵌入之后实现定量扩增，并在PCR后实现曲线分析，以此观察产物是否为之前设定的目的产物。在将该方式应用在炭疽芽孢杆菌检测后，灵敏度在1000拷贝以上。
7.胸膜肺炎放线杆菌检测。根据apx IV A基因序列对相应探针以及引物进行设计，在此基础上实现荧光PCR技术的建立并将其投入应用。经过试验操作，在150份样品当中检测出23份APP阳性的样品。
8.寄生虫病。寄生虫病方面，通过PCR技术的应用实现感染弓虫血液虫体的观察，弓形虫529bp传入大肠杆菌方式实现重组质粒的构建，在将其作为模板的基础上实现荧光PCR标曲建立，对具有特异、快速以及灵敏特征的PCR方式进行了建立。此外，近年来也具有毛圆线虫、立克次氏体以及小隐孢子虫的相关检测报道。
现有各项实时荧光PCR 方法均表明，实时荧光PCR 具有实时、灵敏、快速、精确等优点，使其具有较广阔的研究前景。但染料、探针的选取、设计、和价格昂贵又限制了实时荧光PCR 技术的推广。在未来的研究过程中，一方面要试图找到理想的荧光染色剂，另一方面应当着手进行各类主要疫病的实时荧光PCR 检测方法的建立，为临床检测提供快速、可行、可靠、实际的检测方法。实时荧光PCR 技术将会在动物疫病诊断中得到更加广泛的应用。
参考文献：
[1]李伟，俞东征，海荣.应用TaqMan 荧光RT-PCR 定性定量检测炭疽芽孢杆菌[J].中国人兽共患病杂志，2015，21（4） 16.
[2]陈苏红，张敏丽，牟航.实时荧光定量PCR 法检测炭疽杆菌[J].解放军医学杂志，2016，28 （3） 70.
[3]李树清，易建平，李健.胸膜肺炎放线杆菌的实时荧光PCR 检测[J].畜牧兽医学报，2015 ，36 （9）73.
[4]刘世国，秦川，姚志军. 弓形虫感染家兔血液中虫体的动态观察[J].中国人畜共患病学报，2016，22（2）60.
[5]王频佳，张德纯.荧光PCR 检测弓形虫基因方法的建立[J].临床检验杂志，2015，23 （2） ：25.
关键词：实时荧光定量PCR;动物疫病;诊断
近年来，随着实时荧光定量PCR 技术日趋成熟，多重实时荧光定量PCR （MFQ-PCR）技术也得到进一步发展。多重实时荧光定量PCR 技术，即在同一个反应体系中，同时加入多对引物以及相应的不同荧光分子标记的探针或者荧光染料，一次反应对多个靶基因进行实时定量检测，大大提高了检测效率，这一技术优势使之在临床多种病原体混合感染的筛查上具有广阔的前景。近几年来实时荧光定量PCR 技术，特别是多重实时荧光定量PCR 技术在动物疫病的诊断中也得到了越来越广泛的应用。
一、实时荧光PCR技术在动物疫病诊断
近年来， 随着养牛业迅速发展，尤其奶牛饲养数量不断增多、国际贸易频繁、牛群流动广泛、疫病监测和控制不力等众多因素， 使得牛疫病尤其病毒性传染病旧病未除，新病不断出现和流行。
1.禽流感病毒检测。目前，禽流感已经在世界范围内分布，大部分都为隐性感染，没有特殊临床表现，仅仅有少数类型具有高致病以及传播迅速的特征。由于该病毒具有较为频繁的变异特征，且具有较多的血清类型，在国外，以往经常以鸡胚病毒分离方式进行病毒检测，不仅检测时间较长，且检测血清类型较多。目前，我国已有学者根据病毒型开发设计出具有特异、敏感特征的引物探针，建立出能够实现A型病毒的荧光PCR。
2.新城疫病毒检测。该病毒根据其致病能力的不同可以分为弱毒、中等毒以及强毒力型。在以往诊断中，同样需要以鸡胚病毒分离方式进行检测，所需时间相对较长。在我国建立的荧光PCR法不仅能够将弱新城疫病毒同中强毒力的新城疫病毒进行区分，且不会同常见病毒发生交叉反应，即具有较高的敏感性。通过SYBR技术对新城疫病毒在定量以及定性方面分别开展分析，最终通过融解曲线实现PCR的定性分析。通过荧光PCR在新城疫病毒检测当中的应用，不仅能够获得同鸡胚分离一致的实验结果，且能够证明该方式具有快速、安全、敏感以及特异性特点。
3.鸭乙肝病毒检测。通过SYBR PCR技术的应用对鸭乙肝病毒进行检验，经过检验发现，该技术是对DHBV进行检测的新方式，具有敏感、特异以及简便的特征。对鸭乙肝病毒核酸PCR技术进行了建立，并将其应用在鸭血清病毒核酸监测当中，在实现目标体内复制情况分析的基础上为鸭肝炎病毒在评价、发病机理以及抗病毒疗效预测方面提供了重要依据。
4.猪瘟病毒检测。目前，现有的常规方式很难对带毒猪、隐性感染猪以及弱毒免疫猪进行区分。在猪瘟病毒弱毒疫苗5端非编码区对一条荧光探针以及引物进行了设计，在同LC监测系统相结合的基础上对猪瘟兔化弱毒疫苗的监测方式进行了建立，不仅具有较高的灵敏度，且检测耗时较短，仅仅需要4h。而温国元等，则将5端非编码区作为扩增靶区进行试验，对Tapman探针以及两条引物进行设计，实现了荧光PCR检测方式的建立。该方式灵敏度更高，可以达到10拷贝/μl，具有较好的应用效果。
5.伪狂犬病毒。口蹄疫是一种对偶蹄动物具有强烈传染性的疾病，危害非常大，根据聚合酶3D基因片段以保守区域方式实现探针以及引物的设计，在扩增区当中，口蹄疫病毒A、C、O型序列相同，在将探针同引物共同应用的情况下实现荧光PCR方式的建立，建立的荧光PCR技术，则对传统技术中病毒鉴定准确性差、敏感性差以及用时较长的缺点进行了克服，在对环境污染、病毒扩散缺点积极避免的基础上应用在大批量样品检测当中。
6.炭疽芽孢杆菌检测。Makino等通過炭疽特异性引物实现EQ PCR检测，在该方式中，能够有效地实现空气中细菌芽孢的检测。通过荧光PCR技术的应用，在pXI1质粒上pag基因实现基因探针以及引物的设计，对具有定性、快速、定量以及准确特征的炭疽芽孢杆菌检测方式进行了建立，在pXO1上pag基因以及pXO2上cap基因作为特异引物，在以DNA进行嵌入之后实现定量扩增，并在PCR后实现曲线分析，以此观察产物是否为之前设定的目的产物。在将该方式应用在炭疽芽孢杆菌检测后，灵敏度在1000拷贝以上。
7.胸膜肺炎放线杆菌检测。根据apx IV A基因序列对相应探针以及引物进行设计，在此基础上实现荧光PCR技术的建立并将其投入应用。经过试验操作，在150份样品当中检测出23份APP阳性的样品。
8.寄生虫病。寄生虫病方面，通过PCR技术的应用实现感染弓虫血液虫体的观察，弓形虫529bp传入大肠杆菌方式实现重组质粒的构建，在将其作为模板的基础上实现荧光PCR标曲建立，对具有特异、快速以及灵敏特征的PCR方式进行了建立。此外，近年来也具有毛圆线虫、立克次氏体以及小隐孢子虫的相关检测报道。
现有各项实时荧光PCR 方法均表明，实时荧光PCR 具有实时、灵敏、快速、精确等优点，使其具有较广阔的研究前景。但染料、探针的选取、设计、和价格昂贵又限制了实时荧光PCR 技术的推广。在未来的研究过程中，一方面要试图找到理想的荧光染色剂，另一方面应当着手进行各类主要疫病的实时荧光PCR 检测方法的建立，为临床检测提供快速、可行、可靠、实际的检测方法。实时荧光PCR 技术将会在动物疫病诊断中得到更加广泛的应用。
参考文献：
[1]李伟，俞东征，海荣.应用TaqMan 荧光RT-PCR 定性定量检测炭疽芽孢杆菌[J].中国人兽共患病杂志，2015，21（4） 16.
[2]陈苏红，张敏丽，牟航.实时荧光定量PCR 法检测炭疽杆菌[J].解放军医学杂志，2016，28 （3） 70.
[3]李树清，易建平，李健.胸膜肺炎放线杆菌的实时荧光PCR 检测[J].畜牧兽医学报，2015 ，36 （9）73.
[4]刘世国，秦川，姚志军. 弓形虫感染家兔血液中虫体的动态观察[J].中国人畜共患病学报，2016，22（2）60.
[5]王频佳，张德纯.荧光PCR 检测弓形虫基因方法的建立[J].临床检验杂志，2015，23 （2） ：25.