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【摘要】 目的：对多重PCR和荧光PCR两种核酸检测方法在多项目质控样本中的检测应用进行初步评价。方法：同时采用三种方法对多项目盲样质控样本进行检测，包括多重PCR、荧光PCR及传统的国标方法。结果：食源性致病菌盲样（W-B11）中采用多重PCR、荧光PCR均检出金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌核酸阳性，培养法同步分离并鉴定为金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌，三种方法检测结果一致。结论：PCR法结合培养法对于多项目质控样本中病原菌快速初筛分离具有重要意义，可减少传统培养法漏检的可能性，提高检测效率。
【关键词】 细菌盲样； 聚合酶链反应； 多项目质控考核
【Abstract】 Objective：To evaluate multi-PCR and real-time PCR methods on detection of multi-blind quality control projects.Method：Multi-PCR，real-time PCR and traditional international standard method were used in the blind quality control projects at the same time.Result：Multi-PCR and real-time PCR methods detected W-B11 positive of Staplylcoccus aureus nucleic acid and Bacillus cereus nucleic acid by both.The culture method was isolated and identified as Staphylococcus aureus and Bacillus cereus.The results of the three methods were consistent.Conclusion：The PCR method combined with cultivation method for pathogenic bacteria in the multi projects quality control sample rapid screening has important significance in separation，can reduce the possibility of missing in the traditional training method， improve the detection efficiency.
【Key words】 Bacteria blindness samples； PCR； Multi-blind quality control projects
First-author’s address：Nanjing Municipal Center for Disease Control and Prevention，Nanjing 210000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.04.012
食源性致病菌是危害食品安全和人类健康的主要因素，对食源性致病菌的检测是食品卫生安全检测中一个重要的部分[1-3]。常见的食源性致病菌不仅包括食品中常见的金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、蜡样芽孢菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌等致病性弧菌、变形杆菌属、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌，还应当包含常见的致泻性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌[4-6]。在细菌盲样检测的质控考核中，面临同时检测多种细菌、以免遗漏的问题[7-10]。目前在实际检验工作中常用于检测和鉴定食源性致病菌的方法主要还是分离培养、生化鉴定的方法，本研究中，笔者同时应用多重PCR、荧光PCR、传统分离培养3种方法对江苏省疾病预防控制中心下发的食源性致病菌盲样进行检测，现将检测过程报告如下。
1 材料与方法
1.1 盲样来源 江苏省疾病预防控制中心下发的食源性致病菌盲样W-B11，西林瓶中真空粉末状样品。无菌打开西林瓶，立即（1 min内）加入3 mL稀释液（无菌生理盐水）进行溶解，待溶解后吸出放入无菌瓶中，反复用稀释液清洗西林瓶内壁，稀释液合计50 mL，5瓶总共稀释至250 mL，回收清洗液放入同一无菌瓶中，此溶液是待检样品。
1.2 培养基 3%氯化钠碱性蛋白胨水、mEC肉汤、Bolton肉汤、TTB增菌液、SC增菌液、志贺氏菌增菌肉汤、7.5%氯化钠肉汤、改良磷酸盐缓冲液、mLST-Vm、HE琼脂、改良CCD琼脂平板、改良Y培养基、CIN-1培养基、冻干兔血浆、克氏双糖、營养琼脂、TSA平板、Skirrow平板来源于北京陆桥公司；沙门氏菌显色平板、副溶血性弧菌显色平板、O157显色平板、阪崎肠杆菌显色平板来源于法国科玛嘉；LB1增菌液、LB2增菌液、Baird-Parker琼脂平板、李斯特氏菌显色培养基、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂平板、血平板、蜡样芽孢杆菌生化鉴定盒来源于广东环凯公司。
1.3 核酸提取试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒来源于天根生化科技（北京）有限公司。
1.4 荧光PCR试剂 沙门氏菌/志贺氏菌核酸检测试剂盒、副溶血性弧菌核酸检测试剂盒、空肠弯曲菌核酸检测试剂盒、金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒、李斯特氏菌核酸检测试剂盒、阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒、蜡样芽孢杆菌核酸检测试剂盒、五种致泻性大肠杆菌核酸检测试剂盒、大肠杆菌O157核酸检测试剂盒来源于硕世生物科技有限公司。
1.5 MOKOPOWER 10种食源性致病菌核酸多重检测试剂盒（PCR-毛细管电泳法）和11种致泻细菌核酸多重检测试剂盒（PCR-毛细管电泳法）来源于南京美宁康诚生物科技有限公司。10种食源性致病菌核酸多重检测试剂盒由M0101-A、M0101-B两种PCR反应体系构成，可用于检测金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、大肠埃希氏菌O157和变形杆菌。11种致泻细菌核酸多重检测试剂盒由M0201-A、M0201-B两种PCR反应体系构成，可用于检測11种常见的肠道致病菌，包括霍乱弧菌O1、霍乱弧菌O139、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、大肠杆菌O157、肠产毒素大肠杆菌（ETEC）和肠黏附性大肠杆菌（EAEC）。 1.6 培养方法 中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.4-2010、志贺氏菌检验GB4789.5-2012、副溶血性弧菌检验GB4789.7-2013、金黄色葡萄球菌检验GB4789.10-2010、单核细胞增生李斯特菌检验GB4789.30-2010、阪崎肠杆菌检验GB4789.40-2010、空肠弯曲菌检验 GB4789.9-2014、蜡样芽孢杆菌检验GB4789.14-2014；中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验GB/T4789.8-2008、大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验GB/T4789.36-2008[11-20]。
1.7 核酸提取及荧光PCR检测 待检样品取3 mL按试剂盒说明书操作，提取细菌基因组DNA。依据荧光PCR试剂盒说明书分别配制反应液分装于反应管（20 μL/管），分别加入处理好的待测样本核酸、空白对照、阳性对照各5 μL，终体积25 μL/管。PCR扩增检测：将反应管用API7500荧光定量PCR扩增仪进行扩增检测（循环参数设定依据说明书进行设置），依据试剂盒说明书判定结果。
1.8 多重PCR检测 依据试剂盒说明书操作，体系分装后分别取待检核酸样本5 μL加入到20 μL PCR反应液中，按说明书设置循环操作，PCR产物用Qiagen公司的QIACEL全自动毛细管电泳仪进行检测。
2 结果
2.1 培养结果 在检测依据规定的时间范围内观察结果，HE平板无可疑菌落生长；O157显色平板，仅见少许蓝绿色圆形光滑菌落；沙门氏菌显色平板无菌落生长；阪崎肠杆菌显色平板有少许浅蓝色圆形光滑菌落，转种TSA平板上无黄色可疑菌落；副溶血性弧菌显色平板无菌落生长；Baird-Parker琼脂平板见黑色圆形菌落，外层有一透明圈的可疑菌落；李斯特氏菌显色平板有三种菌落生长，分别是浅蓝色较小圆形菌落无晕圈、白色圆形光滑菌落、金黄色圆形菌落，无可疑菌落；MYP平板微粉红色周围有淡粉红色沉淀环可疑菌落，及浅黄色圆形菌落；志贺氏菌显色平板无可疑菌落生长；Skirrow和CCD琼脂平板均未见可疑菌落；改良Y、CIN-1平板均未见可疑菌落。
挑取Baird-Parker瓊脂平板上黑色圆形外层有一透明圈可疑单菌落做革兰氏染色镜检为革兰氏阳性球菌，呈葡萄球状，在血平板上为金黄色圆形，光滑，湿润，周围可见透明溶血圈，BHI肉汤做血浆凝固酶试验为阳性，样品中检出金黄色葡萄球菌。
MYP平板上微粉红色周围有淡粉红色沉淀环可疑单个菌落在血平板上为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有透明溶血环，根状生长试验为阴性，动力阳性，同时做进一步生化鉴定，见表1。经30 ℃培养24 h并于室温放置3 d的硫酸锰营养琼脂培养物做蛋白质毒素结晶试验，镜下仅见游离芽孢，未见深红色菱形蛋白质结晶体，排除苏云金芽胞菌。综合生化结果及蛋白质毒素结晶试验结果，样品中检出蜡样芽胞杆菌。
2.2 荧光PCR结果 待检样品的金黄色葡萄球菌核酸和蜡样芽胞杆菌核酸阳性，其他菌核酸检测结果均为阴性，具体CT值见表2。
2.3 多重PCR检测结果 10种食源性致病菌（金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、大肠埃希氏菌O157和变形杆菌）核酸多重检测结果表明，金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌核酸阳性，其他菌核酸阴性（图1 M0101-A、M0101-B）。11种致泻细菌（霍乱弧菌O1、霍乱弧菌O139、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、大肠杆菌O157、肠产毒素大肠杆菌（ETEC）和肠黏附性大肠杆菌（EAEC））核酸多重检测结果均为阴性（图1 M0201-A、M0201-B）。
3 讨论
核酸检测法的突出特点是快速、灵敏度高，其主要包括普通PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片、核酸测序等。普通PCR方法一般需要对扩增产物进行凝胶电泳，检测步骤多、时间长，且只能从定性的角度进行分析，灵敏度也不够。基因芯片的方法基于核酸杂交的原理，通量高、分析速度快，但芯片制作以及后续杂交检测都有较高的仪器设备要求，且对样本的浓度要求比较高，一般也很难达到比较高的灵敏度。核酸测序的方法是物种定位最为精确的方法，但对仪器和人员的要求都很高，需要在专业实验室进行。相比之下，实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR或FQ-PCR）技术具有明显的优势。该技术在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能，为样品中靶标序列或基因片段的精确定量提供了一种简单而又方便的方法，是目前国际公认的病原微生物诊断最有效技术之一[21-24]。
本室已采用Real-time PCR技术应用于食源性致病菌初筛检测[25-26]，但目前市场上利用TaqMan技术开发的病原微生物检测试剂盒多是针对单个病原体的特异检测，对于临床样本来说，在样品病原体未知的情况下，经常需要采用多种试剂盒同时进行检测，影响了检测的效率。多重荧光定量PCR技术通过对样本中可能存在的最常见的几种病原体进行同时检测，在优化好的适合多重扩增的体系中加入拟检测的病原体特异引物，实现一次性检测多个病原体，提高检测效率。毛细管电泳仪为多重PCR的发展提供了分辨PCR产物的良好手段，分辨率达3～5 bp，无需配胶、制胶，无需手工上样、人工拍照，多重荧光定量PCR技术结合毛细管电泳仪是今后微生物实验室检测多重病原的一个发展方向。在MOKOPOWER系统中，由于引物对较多，引物二聚体不能完全避免，但均小于100 bp，而PCR产物大小均都在150 bp以上，因此可以明确区分。本文中，笔者对质控样品同时以多重PCR、荧光PCR、传统分离培养3种方法进行检测，检测结果一致。應用多重PCR和荧光PCR可在数小时内得出初筛结果，为培养结果指明方向。PCR快速诊断对大型活动安全保障、食品安全、传染病突发事件的初筛具有重要意义，将其应用于多项目质控样本的检测中，可以减少传统培养方法漏检的可能性，提高检测效率。 参考文献
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（收稿日期：2016-11-22） （本文编辑：周亚杰）
【关键词】 细菌盲样； 聚合酶链反应； 多项目质控考核
【Abstract】 Objective：To evaluate multi-PCR and real-time PCR methods on detection of multi-blind quality control projects.Method：Multi-PCR，real-time PCR and traditional international standard method were used in the blind quality control projects at the same time.Result：Multi-PCR and real-time PCR methods detected W-B11 positive of Staplylcoccus aureus nucleic acid and Bacillus cereus nucleic acid by both.The culture method was isolated and identified as Staphylococcus aureus and Bacillus cereus.The results of the three methods were consistent.Conclusion：The PCR method combined with cultivation method for pathogenic bacteria in the multi projects quality control sample rapid screening has important significance in separation，can reduce the possibility of missing in the traditional training method， improve the detection efficiency.
【Key words】 Bacteria blindness samples； PCR； Multi-blind quality control projects
First-author’s address：Nanjing Municipal Center for Disease Control and Prevention，Nanjing 210000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.04.012
食源性致病菌是危害食品安全和人类健康的主要因素，对食源性致病菌的检测是食品卫生安全检测中一个重要的部分[1-3]。常见的食源性致病菌不仅包括食品中常见的金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、蜡样芽孢菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌等致病性弧菌、变形杆菌属、空肠弯曲菌、阪崎肠杆菌，还应当包含常见的致泻性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌[4-6]。在细菌盲样检测的质控考核中，面临同时检测多种细菌、以免遗漏的问题[7-10]。目前在实际检验工作中常用于检测和鉴定食源性致病菌的方法主要还是分离培养、生化鉴定的方法，本研究中，笔者同时应用多重PCR、荧光PCR、传统分离培养3种方法对江苏省疾病预防控制中心下发的食源性致病菌盲样进行检测，现将检测过程报告如下。
1 材料与方法
1.1 盲样来源 江苏省疾病预防控制中心下发的食源性致病菌盲样W-B11，西林瓶中真空粉末状样品。无菌打开西林瓶，立即（1 min内）加入3 mL稀释液（无菌生理盐水）进行溶解，待溶解后吸出放入无菌瓶中，反复用稀释液清洗西林瓶内壁，稀释液合计50 mL，5瓶总共稀释至250 mL，回收清洗液放入同一无菌瓶中，此溶液是待检样品。
1.2 培养基 3%氯化钠碱性蛋白胨水、mEC肉汤、Bolton肉汤、TTB增菌液、SC增菌液、志贺氏菌增菌肉汤、7.5%氯化钠肉汤、改良磷酸盐缓冲液、mLST-Vm、HE琼脂、改良CCD琼脂平板、改良Y培养基、CIN-1培养基、冻干兔血浆、克氏双糖、營养琼脂、TSA平板、Skirrow平板来源于北京陆桥公司；沙门氏菌显色平板、副溶血性弧菌显色平板、O157显色平板、阪崎肠杆菌显色平板来源于法国科玛嘉；LB1增菌液、LB2增菌液、Baird-Parker琼脂平板、李斯特氏菌显色培养基、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂平板、血平板、蜡样芽孢杆菌生化鉴定盒来源于广东环凯公司。
1.3 核酸提取试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒来源于天根生化科技（北京）有限公司。
1.4 荧光PCR试剂 沙门氏菌/志贺氏菌核酸检测试剂盒、副溶血性弧菌核酸检测试剂盒、空肠弯曲菌核酸检测试剂盒、金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒、李斯特氏菌核酸检测试剂盒、阪崎肠杆菌核酸检测试剂盒、蜡样芽孢杆菌核酸检测试剂盒、五种致泻性大肠杆菌核酸检测试剂盒、大肠杆菌O157核酸检测试剂盒来源于硕世生物科技有限公司。
1.5 MOKOPOWER 10种食源性致病菌核酸多重检测试剂盒（PCR-毛细管电泳法）和11种致泻细菌核酸多重检测试剂盒（PCR-毛细管电泳法）来源于南京美宁康诚生物科技有限公司。10种食源性致病菌核酸多重检测试剂盒由M0101-A、M0101-B两种PCR反应体系构成，可用于检测金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、大肠埃希氏菌O157和变形杆菌。11种致泻细菌核酸多重检测试剂盒由M0201-A、M0201-B两种PCR反应体系构成，可用于检測11种常见的肠道致病菌，包括霍乱弧菌O1、霍乱弧菌O139、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、大肠杆菌O157、肠产毒素大肠杆菌（ETEC）和肠黏附性大肠杆菌（EAEC）。 1.6 培养方法 中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.4-2010、志贺氏菌检验GB4789.5-2012、副溶血性弧菌检验GB4789.7-2013、金黄色葡萄球菌检验GB4789.10-2010、单核细胞增生李斯特菌检验GB4789.30-2010、阪崎肠杆菌检验GB4789.40-2010、空肠弯曲菌检验 GB4789.9-2014、蜡样芽孢杆菌检验GB4789.14-2014；中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验GB/T4789.8-2008、大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验GB/T4789.36-2008[11-20]。
1.7 核酸提取及荧光PCR检测 待检样品取3 mL按试剂盒说明书操作，提取细菌基因组DNA。依据荧光PCR试剂盒说明书分别配制反应液分装于反应管（20 μL/管），分别加入处理好的待测样本核酸、空白对照、阳性对照各5 μL，终体积25 μL/管。PCR扩增检测：将反应管用API7500荧光定量PCR扩增仪进行扩增检测（循环参数设定依据说明书进行设置），依据试剂盒说明书判定结果。
1.8 多重PCR检测 依据试剂盒说明书操作，体系分装后分别取待检核酸样本5 μL加入到20 μL PCR反应液中，按说明书设置循环操作，PCR产物用Qiagen公司的QIACEL全自动毛细管电泳仪进行检测。
2 结果
2.1 培养结果 在检测依据规定的时间范围内观察结果，HE平板无可疑菌落生长；O157显色平板，仅见少许蓝绿色圆形光滑菌落；沙门氏菌显色平板无菌落生长；阪崎肠杆菌显色平板有少许浅蓝色圆形光滑菌落，转种TSA平板上无黄色可疑菌落；副溶血性弧菌显色平板无菌落生长；Baird-Parker琼脂平板见黑色圆形菌落，外层有一透明圈的可疑菌落；李斯特氏菌显色平板有三种菌落生长，分别是浅蓝色较小圆形菌落无晕圈、白色圆形光滑菌落、金黄色圆形菌落，无可疑菌落；MYP平板微粉红色周围有淡粉红色沉淀环可疑菌落，及浅黄色圆形菌落；志贺氏菌显色平板无可疑菌落生长；Skirrow和CCD琼脂平板均未见可疑菌落；改良Y、CIN-1平板均未见可疑菌落。
挑取Baird-Parker瓊脂平板上黑色圆形外层有一透明圈可疑单菌落做革兰氏染色镜检为革兰氏阳性球菌，呈葡萄球状，在血平板上为金黄色圆形，光滑，湿润，周围可见透明溶血圈，BHI肉汤做血浆凝固酶试验为阳性，样品中检出金黄色葡萄球菌。
MYP平板上微粉红色周围有淡粉红色沉淀环可疑单个菌落在血平板上为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有透明溶血环，根状生长试验为阴性，动力阳性，同时做进一步生化鉴定，见表1。经30 ℃培养24 h并于室温放置3 d的硫酸锰营养琼脂培养物做蛋白质毒素结晶试验，镜下仅见游离芽孢，未见深红色菱形蛋白质结晶体，排除苏云金芽胞菌。综合生化结果及蛋白质毒素结晶试验结果，样品中检出蜡样芽胞杆菌。
2.2 荧光PCR结果 待检样品的金黄色葡萄球菌核酸和蜡样芽胞杆菌核酸阳性，其他菌核酸检测结果均为阴性，具体CT值见表2。
2.3 多重PCR检测结果 10种食源性致病菌（金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌、空肠弯曲杆菌、大肠埃希氏菌O157和变形杆菌）核酸多重检测结果表明，金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌核酸阳性，其他菌核酸阴性（图1 M0101-A、M0101-B）。11种致泻细菌（霍乱弧菌O1、霍乱弧菌O139、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、大肠杆菌O157、肠产毒素大肠杆菌（ETEC）和肠黏附性大肠杆菌（EAEC））核酸多重检测结果均为阴性（图1 M0201-A、M0201-B）。
3 讨论
核酸检测法的突出特点是快速、灵敏度高，其主要包括普通PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片、核酸测序等。普通PCR方法一般需要对扩增产物进行凝胶电泳，检测步骤多、时间长，且只能从定性的角度进行分析，灵敏度也不够。基因芯片的方法基于核酸杂交的原理，通量高、分析速度快，但芯片制作以及后续杂交检测都有较高的仪器设备要求，且对样本的浓度要求比较高，一般也很难达到比较高的灵敏度。核酸测序的方法是物种定位最为精确的方法，但对仪器和人员的要求都很高，需要在专业实验室进行。相比之下，实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR或FQ-PCR）技术具有明显的优势。该技术在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能，为样品中靶标序列或基因片段的精确定量提供了一种简单而又方便的方法，是目前国际公认的病原微生物诊断最有效技术之一[21-24]。
本室已采用Real-time PCR技术应用于食源性致病菌初筛检测[25-26]，但目前市场上利用TaqMan技术开发的病原微生物检测试剂盒多是针对单个病原体的特异检测，对于临床样本来说，在样品病原体未知的情况下，经常需要采用多种试剂盒同时进行检测，影响了检测的效率。多重荧光定量PCR技术通过对样本中可能存在的最常见的几种病原体进行同时检测，在优化好的适合多重扩增的体系中加入拟检测的病原体特异引物，实现一次性检测多个病原体，提高检测效率。毛细管电泳仪为多重PCR的发展提供了分辨PCR产物的良好手段，分辨率达3～5 bp，无需配胶、制胶，无需手工上样、人工拍照，多重荧光定量PCR技术结合毛细管电泳仪是今后微生物实验室检测多重病原的一个发展方向。在MOKOPOWER系统中，由于引物对较多，引物二聚体不能完全避免，但均小于100 bp，而PCR产物大小均都在150 bp以上，因此可以明确区分。本文中，笔者对质控样品同时以多重PCR、荧光PCR、传统分离培养3种方法进行检测，检测结果一致。應用多重PCR和荧光PCR可在数小时内得出初筛结果，为培养结果指明方向。PCR快速诊断对大型活动安全保障、食品安全、传染病突发事件的初筛具有重要意义，将其应用于多项目质控样本的检测中，可以减少传统培养方法漏检的可能性，提高检测效率。 参考文献
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（收稿日期：2016-11-22） （本文编辑：周亚杰）