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[摘要] 目的 探讨斑贞1号、川芎嗪（TMP）和五氟尿嘧啶（5-FU）联合逆转人胃癌细胞系SGC-7901/ADR与ERCC1表达的影响。 方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），监测人胃癌细胞SGC-7901/ADR细胞在5-FU组、斑贞1号组、斑贞1号 5-FU组、斑贞1号 5-FU TMP组切除修复交叉互补基因1（ERCC1）mRNA的表达情况。 结果 5-FU组与阴性对照组比较，ERCC1 mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05），而5-FU联合中药斑贞1号及TMP处理组ERCC1mRNA表达量明显升高（P<0.05）。 结论 斑贞1号、TMP和5-FU联合逆转SGC-7901/ADR细胞耐药性可能与ERCC1基因相关，为当前胃癌的治疗提供了新的理论依据。
[关键词] 胃癌；斑贞1号；TMP；5-FU；多药耐药；ERCC1基因
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）26-0034-03
胃癌是中国常见的恶性肿瘤之一，至今为止手术仍是胃癌的主要治疗方法，因早癌诊断率低，70%患者失去手术机会，所以化疗显得非常重要，但目前最大的问题是胃癌多药耐药性（MDR），近几年发现[1，2]ERCC1参与胃癌的多药耐药，并起重要作用，本课题组侯培珍等[3]研究结果示斑贞1号、5-FU和TMP联合对人胃癌有逆转作用。本课题采用RT-PCR方法比较人胃癌细胞（SGC-7901/ADR）经过不同药物组治疗后的ERCC1 mRNA的表达量，进一步探讨各药物组对人胃癌SGC-7901/ADR细胞的作用机制。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞系
胃癌SGC-7901/ADR细胞，第四军医大赠。
1.2 药物、试剂及主要仪器
自拟“斑贞1号”每毫升含露蜂房、山茱萸、斑蝥、女贞子各0.2 g。5-FU（规格：10 mL：0.25 g，国药准字H31020593，上海旭东海普药业有限公司）、TMP（规格40 mg，国药准字H20031302，安徽制药），RPMI1640培养基（RPMI为Roswell Park Memorial Institute缩写，1640是培养基代号，其中含有10%胎牛血清，美国GIBCO北京有限公司），二甲基亚砜、胰蛋白酶（美国Sigma公司产品），新生小牛血清（杭州四季青公司），两步法RT-PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司产品），引物片段（上海生物工程公司），PCR扩增仪（Ambion 公司）、电泳仪及紫外分光度计（北京六一公司），Trizol（TakaRa公司），紫外透视成像系统（上海精科实业有限公司）。
1.3 实验方法
1.3.1细胞处理 取对数生长期的细胞，以5×104/mL浓度接种于6孔板上，每孔用吸管加入2 mL，然后培养24 h，然后分为五组；对照组、5-FU组、斑贞1号组、斑贞1号 5-FU、斑贞1号 5-FU TMP，分别加入等量的新的培养液，5-FU稀释液、斑贞1号稀释液、斑贞1号 5-FU稀释液、斑贞1号 5-FU TMP稀释液。培养48 h后，经过PBS缓冲液冲洗，提取总mRNA。
1.3.2 RT-PCR 提取细胞中的总RNA：以mRNA为模板，采用Oligo随机引物，利用逆转录酶反转录成cDNA。然后再以cDNA作为模板PCR扩增，琼脂糖电泳并拍照，分析电泳条带灰度值，检查基因mRNA转录相对量的变化。具体步骤如下：以mRNA为模板经逆转录合成cDNA， 每个反应体系25 μL，目的基因引物各0.5 μL，Takara Taq 1 μL，10×PCR Buffer（Mg2 Plus）2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，ddH2O 13.5 μL；各样品cDNA 5 μL，灭菌蒸馏水13.5 μL。经过预变性→变性→退火→延伸，（PCR扩增条件分别为94℃ 1 min，58℃ 30 s，72℃ 45 s，72℃ 10 min），共30个循环，最后延伸72℃ 10 min，扩增结束，取10 μL样品，跑电泳60 min，（经100 V恒压，2%琼脂糖）然后采集电泳图像，得出各电泳带光密度值，β -action引物正义列为5’-GTGGG GCGCAGGCACCA-3’，反义列为5’-CTCCTTAATACGCACGATTTC-3’ERCC1基因引物序列的正义列引5-TCAGACCTTCGCCGTATATGC-3’，反义列引物为5’-ACATCCACATGGACCAG-CAGG-3’。
1.4 统计学方法
应用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，进行方差分析及LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胃癌SGC-7901/ADR细胞ERCC1 mRNA的表达情况
5-FU组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。其他药物组与对照组相比及组间比较均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 ERCC1和对照基因β-action的RT-PCR产物经琼脂糖分离后电泳图
切除修复交叉互补基因1（ERCC1）和对照基因（β-action）的RT-PCR产物经琼脂糖分离后分别位于354bp和548bp，见图1。
A、B、C、D、E 分别代表的是阴性对照组（5-FU组、斑贞1号组、斑贞1号 5-FU组、斑贞1号 5-FU TMP组）ERCC1的表达，A1、B1、C1、D1、E1分别代表的是阴性对照组（5-FU组、斑贞1号组、斑贞1号 5-FU组、斑贞1号 5-FU TMP组）β-action的表达
图1 ERCC1和对照基因β-action的RT-PCR产物经琼脂糖分离后电泳图 3 讨论
目前我国胃癌发病率及死亡率位居恶性肿瘤第三位[4]，化疗是胃癌治疗中其重要作用，但大部分药物因多药耐药（MDR）使化疗失败[5]。
近年研究发现ERCC1基因与恶性肿瘤的多药耐药及肿瘤的发生、发展、疗效预测及预后相关。此基因在许多肿瘤组织中表达低下，对头颈部鳞癌的研究发现，ERCC1水平低表达可能是发生头颈部癌的危险因素，在对食管癌和胃食管结合部癌的研究中，发现ERCC1的表达降低与恶性肿瘤的发病率增加有关，在胃癌的研究中也得到了相似的结果。在胃癌的研究中发现[6]ERCC1的表达水平与化疗敏感性密切相关，认为其表达水平对进展期胃癌患者的临床疗效进行有效预测。马冬等[7]回顾性分析发现ERCC1 表达与淋巴结转移相关而与肿瘤大小、浸润深度无关。而胡锵、于东风等[8]研究却发现此基因表达水平与患者性别、年龄、组织学类型、淋巴结转移均无相关性。而李紫燕等[9]研究发现此基因在胃癌组织中表达水平与患者年龄、肿瘤部位、组织学类型、分期及淋巴结转均无关，而与性别有相关，赵国华、吴杰等[10]发现ERCC1阴性的胃癌患者采用5-Fu 和奥沙利铂化疗的疗效更好。李红等[11]研究发现ERCC1 在胃癌组织中的表达与组织学分级及研究中，有无淋巴结转移无明显差异，本课题组先前已证实胃癌细胞对5-FU耐药性，ERCC1（切除修复交叉互补基因）是Westerveld等在1984年发现的，此基因定位于人类第19号染色体短臂13.2～13.3位点上，大小为15 kb，ERCC1基因拥有四种分子量的mRNA，但只有1.1kb mRNA具有核苷酸切除修复作用。关于肿瘤发生和发展的学说认为肿瘤是致癌相关的危险因素暴露造成DNA损伤，再加上DNA修复基因表达低下造成基因损伤不断地在上皮细胞内累积导致癌基因和抑癌基因突变等一系列连续事件作用的结果。ERCC1基因表达低下影响细胞对DNA加合物及核苷酸损伤的修复，可导致p53、K-RAS基因突变增加，从而增加恶性肿瘤的发生率[12]。ERCC1修复了损伤的基因，使基因组保持完好，减少了癌变相关基因的出现，使细胞能保持正常的生物学活性，从而减少癌变的几率，降低了肿瘤的发病率[13，14]。
斑贞1号合剂（斑蝥、露蜂房、女贞子、山茱萸），斑蝥能抑制肿瘤细胞DNA和RNA合成，杀伤肿瘤。它对HeLa细胞及人食管、胃、肝、乳腺癌细胞均有抑制作用，能促进造血干细胞分化，加速粒细胞的释放，很好地对抗了放化疗中血细胞下降，减少了不良反应。TMP通过多种途径对肿瘤起到治疗和逆转多药耐药的作用。杨叶等[15]已证实TMP能增加5-FU对胃癌化疗的敏感性。本实验研究发现斑贞1号、5-FU和TMP三联药物处理组胃癌细胞ERCC1 mRNA 表达量高于其他用药组，差异有统计学意义（P<0.05），说明三种药联合可显著提高ERCC1 mRNA的高表达，增强了治疗效果。
[参考文献]
[1] 柴文刚. ERCC1与RRM1在胰腺癌中的表达及临床意义[D]. 吉林大学，2013.
[2] 王琼，王南瑶，邵国益，等. 基因mRNA表达水平在晚期胃癌化疗敏感性预测中的应用[J]. 实用临床医药杂志，2012，（19）：13-15.
[3] 侯培珍，张娟，赵永峰. 中西药结合对胃癌细胞多药耐药性逆转和诱导凋亡的实验研究[J]. 第四军医大学学报，2008，29（13）：1181-1183.
[4] 郭晓川，张婷婷，苏丹，等. 小肠原发恶性肿瘤根治术后辅助化疗疗效分析[J]. 肿瘤防治研究，2013，40（7）：693-696.
[5] 田君，姚学权，陈彻，等. 进展期胃癌不同切除术式对辅助化疗耐受性的影响[J]. 中国肿瘤外科杂志，2014，（2）：88-92.
[6] 顾术东，茅国新，张曙. 晚期胃癌ERCC1和BRCA1表达与铂类化疗疗效及预后关系？[J]. 现代肿瘤医学，2013， 21（11）：2525-2528.
[7] 马冬，杨冬阳，罗少燕，等. COX-2和ERCC1在胃癌中的表达及其临床意义[J]. 实用医学杂志，2014，（16）：2585-2587.
[8] 胡锵，于东风，刘弋. ERCC1和TUBB3在晚期胃癌组织中的表达及其临床意义[J]. 安徽医药，2015，（5）：891-894.
[9] 李紫燕，张翼，张士虎. 胃癌组织中ERCC1基因实时荧光定量PCR表达及临床意义[J]. 中国卫生产业，2014，（28）：26-28.
[10] 赵国华，吴杰，范中宝，等. ERCC1和TS对奥沙利铂和5-Fu联合化疗的胃癌患者化疗疗效的Meta分析[J]. 实用癌症杂志，2014，（6）：657-659.
[11] 李红，李乾，王祎萌. 中晚期胃癌中ERCC1与CerbB-2的表达及临床意义[J]. 中国热带学，2015，15（8）：997-999.
[12] 杨安，刘平，董媛媛. ERCC1和AKT2在胃癌组织中的表达及其临床意义[J]. 医学临床研究，2014，31（5）：972-974.
[13] 聂莹莹，王权蓉，王瑞. 胃癌组织中HPSE及ERCC1的表达及临床意义[J]. 医学信息，2015，28（7）：26-28.
[14] 左静，孔雁，戚素文，等. ERCC1与消化道肿瘤关系研究进展[J]. 河北北方学院学报：自然科学版，2015，（3）：110-112.
[15] 杨叶，侯培珍，张娟. 川芎嗪联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC-7901/ADR的杀伤作用[J]. 肿瘤防治研究，2008， 35（9）：624-626.
（收稿日期：2016-06-04）
[关键词] 胃癌；斑贞1号；TMP；5-FU；多药耐药；ERCC1基因
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）26-0034-03
胃癌是中国常见的恶性肿瘤之一，至今为止手术仍是胃癌的主要治疗方法，因早癌诊断率低，70%患者失去手术机会，所以化疗显得非常重要，但目前最大的问题是胃癌多药耐药性（MDR），近几年发现[1，2]ERCC1参与胃癌的多药耐药，并起重要作用，本课题组侯培珍等[3]研究结果示斑贞1号、5-FU和TMP联合对人胃癌有逆转作用。本课题采用RT-PCR方法比较人胃癌细胞（SGC-7901/ADR）经过不同药物组治疗后的ERCC1 mRNA的表达量，进一步探讨各药物组对人胃癌SGC-7901/ADR细胞的作用机制。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞系
胃癌SGC-7901/ADR细胞，第四军医大赠。
1.2 药物、试剂及主要仪器
自拟“斑贞1号”每毫升含露蜂房、山茱萸、斑蝥、女贞子各0.2 g。5-FU（规格：10 mL：0.25 g，国药准字H31020593，上海旭东海普药业有限公司）、TMP（规格40 mg，国药准字H20031302，安徽制药），RPMI1640培养基（RPMI为Roswell Park Memorial Institute缩写，1640是培养基代号，其中含有10%胎牛血清，美国GIBCO北京有限公司），二甲基亚砜、胰蛋白酶（美国Sigma公司产品），新生小牛血清（杭州四季青公司），两步法RT-PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司产品），引物片段（上海生物工程公司），PCR扩增仪（Ambion 公司）、电泳仪及紫外分光度计（北京六一公司），Trizol（TakaRa公司），紫外透视成像系统（上海精科实业有限公司）。
1.3 实验方法
1.3.1细胞处理 取对数生长期的细胞，以5×104/mL浓度接种于6孔板上，每孔用吸管加入2 mL，然后培养24 h，然后分为五组；对照组、5-FU组、斑贞1号组、斑贞1号 5-FU、斑贞1号 5-FU TMP，分别加入等量的新的培养液，5-FU稀释液、斑贞1号稀释液、斑贞1号 5-FU稀释液、斑贞1号 5-FU TMP稀释液。培养48 h后，经过PBS缓冲液冲洗，提取总mRNA。
1.3.2 RT-PCR 提取细胞中的总RNA：以mRNA为模板，采用Oligo随机引物，利用逆转录酶反转录成cDNA。然后再以cDNA作为模板PCR扩增，琼脂糖电泳并拍照，分析电泳条带灰度值，检查基因mRNA转录相对量的变化。具体步骤如下：以mRNA为模板经逆转录合成cDNA， 每个反应体系25 μL，目的基因引物各0.5 μL，Takara Taq 1 μL，10×PCR Buffer（Mg2 Plus）2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，ddH2O 13.5 μL；各样品cDNA 5 μL，灭菌蒸馏水13.5 μL。经过预变性→变性→退火→延伸，（PCR扩增条件分别为94℃ 1 min，58℃ 30 s，72℃ 45 s，72℃ 10 min），共30个循环，最后延伸72℃ 10 min，扩增结束，取10 μL样品，跑电泳60 min，（经100 V恒压，2%琼脂糖）然后采集电泳图像，得出各电泳带光密度值，β -action引物正义列为5’-GTGGG GCGCAGGCACCA-3’，反义列为5’-CTCCTTAATACGCACGATTTC-3’ERCC1基因引物序列的正义列引5-TCAGACCTTCGCCGTATATGC-3’，反义列引物为5’-ACATCCACATGGACCAG-CAGG-3’。
1.4 统计学方法
应用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，进行方差分析及LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胃癌SGC-7901/ADR细胞ERCC1 mRNA的表达情况
5-FU组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。其他药物组与对照组相比及组间比较均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 ERCC1和对照基因β-action的RT-PCR产物经琼脂糖分离后电泳图
切除修复交叉互补基因1（ERCC1）和对照基因（β-action）的RT-PCR产物经琼脂糖分离后分别位于354bp和548bp，见图1。
A、B、C、D、E 分别代表的是阴性对照组（5-FU组、斑贞1号组、斑贞1号 5-FU组、斑贞1号 5-FU TMP组）ERCC1的表达，A1、B1、C1、D1、E1分别代表的是阴性对照组（5-FU组、斑贞1号组、斑贞1号 5-FU组、斑贞1号 5-FU TMP组）β-action的表达
图1 ERCC1和对照基因β-action的RT-PCR产物经琼脂糖分离后电泳图 3 讨论
目前我国胃癌发病率及死亡率位居恶性肿瘤第三位[4]，化疗是胃癌治疗中其重要作用，但大部分药物因多药耐药（MDR）使化疗失败[5]。
近年研究发现ERCC1基因与恶性肿瘤的多药耐药及肿瘤的发生、发展、疗效预测及预后相关。此基因在许多肿瘤组织中表达低下，对头颈部鳞癌的研究发现，ERCC1水平低表达可能是发生头颈部癌的危险因素，在对食管癌和胃食管结合部癌的研究中，发现ERCC1的表达降低与恶性肿瘤的发病率增加有关，在胃癌的研究中也得到了相似的结果。在胃癌的研究中发现[6]ERCC1的表达水平与化疗敏感性密切相关，认为其表达水平对进展期胃癌患者的临床疗效进行有效预测。马冬等[7]回顾性分析发现ERCC1 表达与淋巴结转移相关而与肿瘤大小、浸润深度无关。而胡锵、于东风等[8]研究却发现此基因表达水平与患者性别、年龄、组织学类型、淋巴结转移均无相关性。而李紫燕等[9]研究发现此基因在胃癌组织中表达水平与患者年龄、肿瘤部位、组织学类型、分期及淋巴结转均无关，而与性别有相关，赵国华、吴杰等[10]发现ERCC1阴性的胃癌患者采用5-Fu 和奥沙利铂化疗的疗效更好。李红等[11]研究发现ERCC1 在胃癌组织中的表达与组织学分级及研究中，有无淋巴结转移无明显差异，本课题组先前已证实胃癌细胞对5-FU耐药性，ERCC1（切除修复交叉互补基因）是Westerveld等在1984年发现的，此基因定位于人类第19号染色体短臂13.2～13.3位点上，大小为15 kb，ERCC1基因拥有四种分子量的mRNA，但只有1.1kb mRNA具有核苷酸切除修复作用。关于肿瘤发生和发展的学说认为肿瘤是致癌相关的危险因素暴露造成DNA损伤，再加上DNA修复基因表达低下造成基因损伤不断地在上皮细胞内累积导致癌基因和抑癌基因突变等一系列连续事件作用的结果。ERCC1基因表达低下影响细胞对DNA加合物及核苷酸损伤的修复，可导致p53、K-RAS基因突变增加，从而增加恶性肿瘤的发生率[12]。ERCC1修复了损伤的基因，使基因组保持完好，减少了癌变相关基因的出现，使细胞能保持正常的生物学活性，从而减少癌变的几率，降低了肿瘤的发病率[13，14]。
斑贞1号合剂（斑蝥、露蜂房、女贞子、山茱萸），斑蝥能抑制肿瘤细胞DNA和RNA合成，杀伤肿瘤。它对HeLa细胞及人食管、胃、肝、乳腺癌细胞均有抑制作用，能促进造血干细胞分化，加速粒细胞的释放，很好地对抗了放化疗中血细胞下降，减少了不良反应。TMP通过多种途径对肿瘤起到治疗和逆转多药耐药的作用。杨叶等[15]已证实TMP能增加5-FU对胃癌化疗的敏感性。本实验研究发现斑贞1号、5-FU和TMP三联药物处理组胃癌细胞ERCC1 mRNA 表达量高于其他用药组，差异有统计学意义（P<0.05），说明三种药联合可显著提高ERCC1 mRNA的高表达，增强了治疗效果。
[参考文献]
[1] 柴文刚. ERCC1与RRM1在胰腺癌中的表达及临床意义[D]. 吉林大学，2013.
[2] 王琼，王南瑶，邵国益，等. 基因mRNA表达水平在晚期胃癌化疗敏感性预测中的应用[J]. 实用临床医药杂志，2012，（19）：13-15.
[3] 侯培珍，张娟，赵永峰. 中西药结合对胃癌细胞多药耐药性逆转和诱导凋亡的实验研究[J]. 第四军医大学学报，2008，29（13）：1181-1183.
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[5] 田君，姚学权，陈彻，等. 进展期胃癌不同切除术式对辅助化疗耐受性的影响[J]. 中国肿瘤外科杂志，2014，（2）：88-92.
[6] 顾术东，茅国新，张曙. 晚期胃癌ERCC1和BRCA1表达与铂类化疗疗效及预后关系？[J]. 现代肿瘤医学，2013， 21（11）：2525-2528.
[7] 马冬，杨冬阳，罗少燕，等. COX-2和ERCC1在胃癌中的表达及其临床意义[J]. 实用医学杂志，2014，（16）：2585-2587.
[8] 胡锵，于东风，刘弋. ERCC1和TUBB3在晚期胃癌组织中的表达及其临床意义[J]. 安徽医药，2015，（5）：891-894.
[9] 李紫燕，张翼，张士虎. 胃癌组织中ERCC1基因实时荧光定量PCR表达及临床意义[J]. 中国卫生产业，2014，（28）：26-28.
[10] 赵国华，吴杰，范中宝，等. ERCC1和TS对奥沙利铂和5-Fu联合化疗的胃癌患者化疗疗效的Meta分析[J]. 实用癌症杂志，2014，（6）：657-659.
[11] 李红，李乾，王祎萌. 中晚期胃癌中ERCC1与CerbB-2的表达及临床意义[J]. 中国热带学，2015，15（8）：997-999.
[12] 杨安，刘平，董媛媛. ERCC1和AKT2在胃癌组织中的表达及其临床意义[J]. 医学临床研究，2014，31（5）：972-974.
[13] 聂莹莹，王权蓉，王瑞. 胃癌组织中HPSE及ERCC1的表达及临床意义[J]. 医学信息，2015，28（7）：26-28.
[14] 左静，孔雁，戚素文，等. ERCC1与消化道肿瘤关系研究进展[J]. 河北北方学院学报：自然科学版，2015，（3）：110-112.
[15] 杨叶，侯培珍，张娟. 川芎嗪联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC-7901/ADR的杀伤作用[J]. 肿瘤防治研究，2008， 35（9）：624-626.
（收稿日期：2016-06-04）