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【摘要】目的：比较杜仲不同“发汗”方法制品中绿原酸的含量，为建立杜仲合理化产地加工标准体系提供科学依据。方法：采用高效液相色谱法测定绿原酸含量。结果：与生品比较：传统“发汗”品和其他“发汗”品中绿原酸含量显著降低（P﹤0.01）;与传统“发汗”品比较，其他“发汗”品对绿原酸含量的影响均具显著性差异（P﹤0.01），以60℃烘至半干后“发汗”品最高，煮后“发汗”品最低。结论：采用适宜的其他“发汗”方法较传统“发汗”方法虽能提高杜仲制品中绿原酸含量，但含量远低于生品;如临床应用以绿原酸药理作用为主时，建议不采用“发汗”加工方法制品。
【关键词】杜仲;发汗;绿原酸;含量;高效液相色谱法
【中图分类号】R283【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）1-0028-03
杜仲药材由杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的新鲜树皮加工制备而成，具有补肝肾、强筋骨和安胎的功能，主治肝肾不足引起的腰膝酸软、筋骨无力，眩晕，妊娠漏血和胎动不安等症状，我国西南部和长江中上游等地区为其主产地[1]。文献资料表明，其所含绿原酸具有增强机体免疫功能、降血压、调血脂、抗疲劳、抗氧化、抗炎抗病毒、利胆和兴奋中枢神经系统等广泛的药理作用[2-3]，是杜仲广泛生物活性的重要物质基础。
产地加工是保证药材质量和增强疗效的重要技术手段。“发汗”作为杜仲的一种特殊加工方法，在历版《中国药典》均有记载，其方法的科学性在以降压作用或降压活性成分（松脂醇二葡萄糖苷）作为评价指标的研究报道中得到验证[4-5]。本试验以杜仲绿原酸为评价指标，对其生品、传统“发汗”方法制品和其他“发汗”方法制品中绿原酸量进行测定和比较，以明确基于杜仲绿原酸生物活性的适宜产地加工方法，为指导其产地加工提供科学的理论依据。
1仪器与材料
1.1仪器Agilent1260InfinityII型液相色谱系统（北京安捷伦公司）;AS10200A型超声波清洗机（杭州汇尔公司）;DHG-9240A型真空干燥箱（上海金山公司）;METTLER-AE240型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。
1.2材料杜仲新鲜树皮（样品编号：180518）由都匀市小围寨镇杜仲种植园提供，生长期均在15年以上，经黔南民族医学高等专科学校药学系中药教研室李香副教授鉴定为杜仲科植物EucommiaulmoidesOliv.的树皮。绿原酸标准品（批号：110753-201716，中国食品药品检定研究院）;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1样品的制备
2.1.1生品（A1）将新鲜树皮刮去粗皮，晒干后密封储存。
2.1.2传统“发汗”品（A2）取新鲜树皮刮去粗皮，将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。
2.1.3阴至半干后“发汗”品（A3）将新鲜树皮刮去粗皮，于阴凉通风处晾至半干后（3d），将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。
2.1.4晒至半干后“发汗”品（A4）将新鲜树皮刮去粗皮，晒至半干后（8h），将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。
2.1.5[JP2]烘至半干后“发汗”品（A5）將新鲜树皮刮去粗皮，于烘箱中60℃（2h）烘至半干后，将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。[JP]2.1.6煮后“发汗”品（A6）将新鲜树皮刮去粗皮，于沸水中煮10min后，捞出，将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。
2.1.7蒸后“发汗”品（A7）将新鲜树皮刮去粗皮，于笼屉内隔水蒸10min（按“圆气”后计）后，取出，将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。
2.2绿原酸的测定
2.2.1[JP2]色谱条件色谱柱：DiamonsilC18柱（5μm，250mm×4.6mm）;流动相甲醇-1%醋酸水溶液（17：83）;检测波长：237nm;柱温：25℃;流速：1.0mL/min;进样量：20μL。色谱图见图1。[JP]
2.2.2供试品溶液的制备[6]取各样品杜仲药材约3g，剪成碎片后揉成絮状，精密称取1g置具塞锥形瓶中，加入20%甲醇50mL，称定质量，超声提取60min后放冷至室温，用20%甲醇补足减失质量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。按上操作，各样品均制备3份供试品溶液，冷藏备用。
2.2.3标准品溶液的制备精密称取绿原酸标准品一定量，加流动相定容至10mL容量瓶，摇匀后即得0.995mg·mL-1标准品溶液。
2.2.4标准曲线的制备精密移取绿原酸标准品溶液不同体积分数，按“2.2.1”色谱条件测定，以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标作标准曲线，得回归方程为：Y=44.9310X+6.3067，r=0.9999。绿原酸在0.995～19.9μg范围内线性关系良好。
2.2.5方法学考察取标准品溶液10μL，按“2.2.1”项下方法，连续测定6次吸光度，峰面积的RSD值为1.63%，说明测量仪器的精密度较高。取标准品溶液10μL，按“2.2.1”项下方法，分别在0、0.5、1、1.5、2、3h测定吸光度，峰面积的RSD值为3.58%，说明绿原酸在3h内测定的稳定性良好。取A2样品5份，按“2.2.2”项制备供试品溶液，取供试品溶液10μL，按“2.2.1”项下方法测定，峰面积的RSD值为3.06%，说明方法的重现性良好。取已知含绿原酸量的A2样品5份，加入适量标准品，按“2.2.2”项制备供试品溶液，取供试品溶液10μL，按“2.2.1”项下方法测定，绿原酸平均回收率为97.67%，RSD值为2.27%，说明该方法的可行性较高。 2.2.6含量测定精密移取各样品提取所得供试品溶液20μL，按“2.2.1”项下方法操作并计算绿原酸质量分数，结果见表1。
2.3结果分析
2.3.1与生品（A1）比较传统“发汗”品（A2）和其他“发汗”品（A3-A7）对绿原酸含量的影响均具极显著性差异（P﹤0.01），降低明显，尤以煮后“发汗”品（A6）和蒸后“发汗”品（A7）为甚。究其原因，主要与绿原酸的性质有关：一是热敏性，高温下绿原酸的化学结构极易被破坏，因而煮后“发汗”品和蒸后“发汗”品含量极低;二是水解和分子内酯基迁移的异构现象，“发汗”加工时因采用覆盖物，导致水分气化速率慢，散失较少，绿原酸发生水解和分子内酯基迁移的异构现象可能性增大，因而含量降低。该试验结果验明，采用“发汗”加工方法不能提升杜仲生品绿原酸的含量。
2.3.2与传统“发汗”品（A2）比较其他“发汗”品（A3-A7）对绿原酸含量的影响均具极显著性差异（P﹤0.01）。阴至半干后“发汗”品（A3）、晒至半干后“发汗”品（A4）和烘至半干后“发汗”品（A5）绿原酸含量依次显著增高;煮后“发汗”品（A6）和蒸后“发汗”品（A7）绿原酸含量显著降低。依次增高的原因是通过采用适当干燥方法使“发汗”药材部分水分散失，减少了绿原酸发生水解和分子内酯基迁移的异构现象可能性，三种方法中以烘至半干后“发汗”水分散失最快。该试验结果表明，采用其他“发汗”加工方法提升传统“发汗”加工方法制品中绿原酸含量具有差异化。
3讨论
“发汗”是杜仲的一种传统产地加工方法，对增强杜仲疗效和提升质量具有重要意义，其科学性和合理性在杜仲用于降压的应用中得到验证。但杜仲作为一种常用中药材，生物活性广泛，产生活性的物质基础众多，除降压物质木质素类（主要是松脂醇二葡萄糖苷）外，亦含环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、绿原酸类、杜仲胶和抗真菌蛋白等，具有增强免疫力、降血糖、调血脂、保肝利胆、利尿、保护神经细胞、调节骨代谢、补肝护肾、安胎等生物活性[2]，传统“发汗”加工方法对上述活性物质和生物活性的影响如何，是否均能增强其生物活性，目前未见相关的研究报道。同时，随着科学技术的进步，对需“发汗”加工药材的方法研究呈现多样性变化[7-8]，对提升“发汗”药材的疗效和质量意义重大，而杜仲“发汗”新方法的研究亦未见。故选用传统“发汗”加工方法的杜仲治疗除高血压症外其他疾病，存在一定科学性和合理性不足的问题，因而有必要对其不同活性物质开展有针对性的“发汗”加工方法研究。
本试验以杜仲的活性成分绿原酸为考察指标，测定并比较杜仲生品与不同“发汗”制品中绿原酸量。结果表明，杜仲“发汗”加工制品绿原酸含量均低于生品;其他“发汗”方法制品与传统“发汗”方法制品绿原酸含量有差异化，适宜的“发汗”方法可提高传统“发汗”方法绿原酸的含量。该结果提示，如从绿原酸的量效关系角度评价，杜仲采用“发汗”加工方法是不科学的。考虑到“发汗”药材的目的除提升质量和增强疗效外，还有利于生物组织内部的微生物和功能酶系促发资源性化学物质的生物转化与化学转化;有利于改善药材性状，使之外观美观，质地致密，香气味更为浓郁、醇厚;有助于增强或平抑药材的某一偏性，以达到改变或缓和药性的目的等作用，因而杜仲采用“发汗”加工方法是否具有一定的合理性，仍需不断的深入研究。综上所述，如临床应用以杜仲绿原酸的药理作用为主，就目前《药典》记载的杜仲加工方法，结合现有研究的情况，建议不采用“发汗”加工方法的制品。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：240.
[2]王娟娟，秦血梅，高曉霞，等.杜仲化学成分、药理活性和质量控制现状研究进展[J].中草药，2017，48（15）：3228-3237.
[3]刑丽娜，周明眉，李云，等.绿原酸及其肠道代谢产物对中枢神经系统疾病的作用和机制研究进展[J].中国中药杂志，2015，40（6）：1044-1047.
[4]王丽娜，杨美华.传统发汗方法对杜仲降压作用的影响[C]//中国药学会：2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集，2010：5160-5166.
[5]刘金圣，吴德康，狄留庆，等.杜仲不同加工方法对其质量的影响[J].中医药信息，2007，14（12）：39-40.
[6]孙利伟，赵辉，蔡楠楠.正交试验优选杜仲中绿原酸的提取工艺[J].中国药业，2011，20（18）：41-43.
[7]刘艳，李玮，王建科，等.综合评分法优选川续断产地加工方法[J].中药材，2012，35（12）：1922-1924.
[8]胡慧玲，卫莹芳，马雪玮，等.不同加工方法对厚朴主要化学成分的影响研究[J].中成药，2011，33（5）：834-837.
（收稿日期：2018-10-27编辑：刘斌）
【关键词】杜仲;发汗;绿原酸;含量;高效液相色谱法
【中图分类号】R283【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）1-0028-03
杜仲药材由杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的新鲜树皮加工制备而成，具有补肝肾、强筋骨和安胎的功能，主治肝肾不足引起的腰膝酸软、筋骨无力，眩晕，妊娠漏血和胎动不安等症状，我国西南部和长江中上游等地区为其主产地[1]。文献资料表明，其所含绿原酸具有增强机体免疫功能、降血压、调血脂、抗疲劳、抗氧化、抗炎抗病毒、利胆和兴奋中枢神经系统等广泛的药理作用[2-3]，是杜仲广泛生物活性的重要物质基础。
产地加工是保证药材质量和增强疗效的重要技术手段。“发汗”作为杜仲的一种特殊加工方法，在历版《中国药典》均有记载，其方法的科学性在以降压作用或降压活性成分（松脂醇二葡萄糖苷）作为评价指标的研究报道中得到验证[4-5]。本试验以杜仲绿原酸为评价指标，对其生品、传统“发汗”方法制品和其他“发汗”方法制品中绿原酸量进行测定和比较，以明确基于杜仲绿原酸生物活性的适宜产地加工方法，为指导其产地加工提供科学的理论依据。
1仪器与材料
1.1仪器Agilent1260InfinityII型液相色谱系统（北京安捷伦公司）;AS10200A型超声波清洗机（杭州汇尔公司）;DHG-9240A型真空干燥箱（上海金山公司）;METTLER-AE240型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。
1.2材料杜仲新鲜树皮（样品编号：180518）由都匀市小围寨镇杜仲种植园提供，生长期均在15年以上，经黔南民族医学高等专科学校药学系中药教研室李香副教授鉴定为杜仲科植物EucommiaulmoidesOliv.的树皮。绿原酸标准品（批号：110753-201716，中国食品药品检定研究院）;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1样品的制备
2.1.1生品（A1）将新鲜树皮刮去粗皮，晒干后密封储存。
2.1.2传统“发汗”品（A2）取新鲜树皮刮去粗皮，将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。
2.1.3阴至半干后“发汗”品（A3）将新鲜树皮刮去粗皮，于阴凉通风处晾至半干后（3d），将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。
2.1.4晒至半干后“发汗”品（A4）将新鲜树皮刮去粗皮，晒至半干后（8h），将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。
2.1.5[JP2]烘至半干后“发汗”品（A5）將新鲜树皮刮去粗皮，于烘箱中60℃（2h）烘至半干后，将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。[JP]2.1.6煮后“发汗”品（A6）将新鲜树皮刮去粗皮，于沸水中煮10min后，捞出，将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。
2.1.7蒸后“发汗”品（A7）将新鲜树皮刮去粗皮，于笼屉内隔水蒸10min（按“圆气”后计）后，取出，将树皮内表面两两相对层层叠放，盖上稻草，使其“发汗”，至内表面紫褐色时，取出晒干后密封储存。
2.2绿原酸的测定
2.2.1[JP2]色谱条件色谱柱：DiamonsilC18柱（5μm，250mm×4.6mm）;流动相甲醇-1%醋酸水溶液（17：83）;检测波长：237nm;柱温：25℃;流速：1.0mL/min;进样量：20μL。色谱图见图1。[JP]
2.2.2供试品溶液的制备[6]取各样品杜仲药材约3g，剪成碎片后揉成絮状，精密称取1g置具塞锥形瓶中，加入20%甲醇50mL，称定质量，超声提取60min后放冷至室温，用20%甲醇补足减失质量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。按上操作，各样品均制备3份供试品溶液，冷藏备用。
2.2.3标准品溶液的制备精密称取绿原酸标准品一定量，加流动相定容至10mL容量瓶，摇匀后即得0.995mg·mL-1标准品溶液。
2.2.4标准曲线的制备精密移取绿原酸标准品溶液不同体积分数，按“2.2.1”色谱条件测定，以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标作标准曲线，得回归方程为：Y=44.9310X+6.3067，r=0.9999。绿原酸在0.995～19.9μg范围内线性关系良好。
2.2.5方法学考察取标准品溶液10μL，按“2.2.1”项下方法，连续测定6次吸光度，峰面积的RSD值为1.63%，说明测量仪器的精密度较高。取标准品溶液10μL，按“2.2.1”项下方法，分别在0、0.5、1、1.5、2、3h测定吸光度，峰面积的RSD值为3.58%，说明绿原酸在3h内测定的稳定性良好。取A2样品5份，按“2.2.2”项制备供试品溶液，取供试品溶液10μL，按“2.2.1”项下方法测定，峰面积的RSD值为3.06%，说明方法的重现性良好。取已知含绿原酸量的A2样品5份，加入适量标准品，按“2.2.2”项制备供试品溶液，取供试品溶液10μL，按“2.2.1”项下方法测定，绿原酸平均回收率为97.67%，RSD值为2.27%，说明该方法的可行性较高。 2.2.6含量测定精密移取各样品提取所得供试品溶液20μL，按“2.2.1”项下方法操作并计算绿原酸质量分数，结果见表1。
2.3结果分析
2.3.1与生品（A1）比较传统“发汗”品（A2）和其他“发汗”品（A3-A7）对绿原酸含量的影响均具极显著性差异（P﹤0.01），降低明显，尤以煮后“发汗”品（A6）和蒸后“发汗”品（A7）为甚。究其原因，主要与绿原酸的性质有关：一是热敏性，高温下绿原酸的化学结构极易被破坏，因而煮后“发汗”品和蒸后“发汗”品含量极低;二是水解和分子内酯基迁移的异构现象，“发汗”加工时因采用覆盖物，导致水分气化速率慢，散失较少，绿原酸发生水解和分子内酯基迁移的异构现象可能性增大，因而含量降低。该试验结果验明，采用“发汗”加工方法不能提升杜仲生品绿原酸的含量。
2.3.2与传统“发汗”品（A2）比较其他“发汗”品（A3-A7）对绿原酸含量的影响均具极显著性差异（P﹤0.01）。阴至半干后“发汗”品（A3）、晒至半干后“发汗”品（A4）和烘至半干后“发汗”品（A5）绿原酸含量依次显著增高;煮后“发汗”品（A6）和蒸后“发汗”品（A7）绿原酸含量显著降低。依次增高的原因是通过采用适当干燥方法使“发汗”药材部分水分散失，减少了绿原酸发生水解和分子内酯基迁移的异构现象可能性，三种方法中以烘至半干后“发汗”水分散失最快。该试验结果表明，采用其他“发汗”加工方法提升传统“发汗”加工方法制品中绿原酸含量具有差异化。
3讨论
“发汗”是杜仲的一种传统产地加工方法，对增强杜仲疗效和提升质量具有重要意义，其科学性和合理性在杜仲用于降压的应用中得到验证。但杜仲作为一种常用中药材，生物活性广泛，产生活性的物质基础众多，除降压物质木质素类（主要是松脂醇二葡萄糖苷）外，亦含环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、绿原酸类、杜仲胶和抗真菌蛋白等，具有增强免疫力、降血糖、调血脂、保肝利胆、利尿、保护神经细胞、调节骨代谢、补肝护肾、安胎等生物活性[2]，传统“发汗”加工方法对上述活性物质和生物活性的影响如何，是否均能增强其生物活性，目前未见相关的研究报道。同时，随着科学技术的进步，对需“发汗”加工药材的方法研究呈现多样性变化[7-8]，对提升“发汗”药材的疗效和质量意义重大，而杜仲“发汗”新方法的研究亦未见。故选用传统“发汗”加工方法的杜仲治疗除高血压症外其他疾病，存在一定科学性和合理性不足的问题，因而有必要对其不同活性物质开展有针对性的“发汗”加工方法研究。
本试验以杜仲的活性成分绿原酸为考察指标，测定并比较杜仲生品与不同“发汗”制品中绿原酸量。结果表明，杜仲“发汗”加工制品绿原酸含量均低于生品;其他“发汗”方法制品与传统“发汗”方法制品绿原酸含量有差异化，适宜的“发汗”方法可提高传统“发汗”方法绿原酸的含量。该结果提示，如从绿原酸的量效关系角度评价，杜仲采用“发汗”加工方法是不科学的。考虑到“发汗”药材的目的除提升质量和增强疗效外，还有利于生物组织内部的微生物和功能酶系促发资源性化学物质的生物转化与化学转化;有利于改善药材性状，使之外观美观，质地致密，香气味更为浓郁、醇厚;有助于增强或平抑药材的某一偏性，以达到改变或缓和药性的目的等作用，因而杜仲采用“发汗”加工方法是否具有一定的合理性，仍需不断的深入研究。综上所述，如临床应用以杜仲绿原酸的药理作用为主，就目前《药典》记载的杜仲加工方法，结合现有研究的情况，建议不采用“发汗”加工方法的制品。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：240.
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[3]刑丽娜，周明眉，李云，等.绿原酸及其肠道代谢产物对中枢神经系统疾病的作用和机制研究进展[J].中国中药杂志，2015，40（6）：1044-1047.
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[7]刘艳，李玮，王建科，等.综合评分法优选川续断产地加工方法[J].中药材，2012，35（12）：1922-1924.
[8]胡慧玲，卫莹芳，马雪玮，等.不同加工方法对厚朴主要化学成分的影响研究[J].中成药，2011，33（5）：834-837.
（收稿日期：2018-10-27编辑：刘斌）