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摘要：【目的】克隆海岛棉品种新海15中单萜合成酶基因（GbTPS），研究其受黄萎病诱导的表达情况，为进一步研究该基因在棉花抗黄萎病中的功能打下基础。【方法】克隆GbTPS基因的开放阅读框（ORF）全长序列，对其蛋白序列进行生物信息学分析，并采用实时荧光定量PCR及病毒诱导的基因沉默对其抗病性进行分析。【结果】通过PCR扩增得到一个全长为1761 bp的ORF序列，命名为GbTPS（GenBank登录号：KP247548）。生物信息学分析发现，该基因编码586个氨基酸，预测分子量为67.7 kD，等电点为5.79。系统进化树分析结果表明，GbTPS属于Tps-g亚家族。GbTPS基因经黄萎病菌诱导后，表达量在4～24 h内显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于空白对照组。病毒诱导的基因沉默受黄萎病诱导后其病情指数为52.38，与对照组相比并无明显差异。【结论】GbTPS基因仅在棉花抗黄萎病的早期发挥积极作用。
关键词： 棉花；单萜合酶；GbTPS基因；黄萎病；实时荧光定量PCR
中图分类号： S562；Q344 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0604-07
Abstract：【Objective】A monoterpene synthetase gene GbTPS was cloned from Gossypiumbar badense， and its expression induced by Verticillium wilt were analysed， in order to lay a foundation for studying resistance of cotton to Verticillium wilt. 【Method】The full-length open reading frame（ORF） of GbTPS gene was cloned， and its encoded protein was analysed by bioinformatics， the real-time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR） and virus induced gene silencing was used to analyse resistance to Verticillium wilt. 【Result】Full-length ORF was obtained， with length of 1761 bp， and named GbTPS（Genebank accession number： KP247548）. The bioinformatics analysis showed that， the protein composed of 586 amino acids was coded by GbTPS gene， its predicted molecular weight was 67.7 kD， its isoelectric point was 5.79. Phylogenetic tree analysis showed that， GbTPS belonged to Tps-g subfamily. The expression of GbTPS gene was significant（P<0.05） or extermely significant（P<0.01） higher than that of blank control within 4-24 h after being induced by Verticillium dahlia. The disease index of virus induced gene silencing was 52.38， and had no significant difference with that of control. 【Conclusion】Only at the early stage， the GbTPS gene plays a positive role in resistance to cotton Verticillium wilt.
Key words： cotton； monoterpene synthase； GbTPS gene； Verticillium wilt； qRT-PCR
0 引言
【研究意義】棉花是一种重要的经济作物，在我国乃至世界的经济发展中有着重要地位，是棉制品和服装的重要材料来源，但生产中易受黄萎病菌的侵害而导致大量减产。萜类化合物是植物中种类最多的一类天然烃类化合物，又名类异戊二烯。目前，已分离到的萜类达4万多种（胡永健等，2007）。植物中的萜类化合物包括初生代谢物和次生代谢物，其中次生代谢萜类化合物具有抗病虫害的重要作用。随着分子生物学的发展，萜类合成的关键酶及其在防御作用中的分子机理逐渐成为植物防御研究中的热点之一。萜类合成酶（Terpene Synthases，TPS）是萜类合成过程中的关键酶，也是棉花抗黄萎病过程中的一种重要酶，如δ杜松烯合成酶是合成棉花抗毒素的关键酶（Tan et al.，2000）。抗病基因在抗病过程中起着识别病原菌和开启抗病信号途径的重要作用，而萜类合成酶受萜类合成酶基因的调控。因此，研究萜类合成酶的相关基因是研究萜类化合物抗病性的关键。【前人研究进展】Mace等（1985）在研究萜类物质的过程中发现，脱氧半棉酚对黄萎病菌的抗性优于脱氧半棉酚甲醚、半棉酚和半棉酚甲醚。Mace等（1989）对感染黄萎病的海岛棉进行基因表达分析，结果发现与萜烯生物合成途径相关的基因均受黄萎病诱导表达。Kawchuk等（2001）从番茄中克隆到Ve1、Ve2两个抗黄萎病基因。Zuo等（2005，2007）在接种黄萎病V991的海岛棉7124中克隆获得2个与乙烯信号传导途径相关的基因（GbERF1和GbERF2），后续研究证明它们可能在海岛棉抗黄萎病的过程中发挥一定作用。【本研究切入点】目前，前人已进行了棉花黄萎病菌致病力分化（林玲等，2005；乔艳艳等，2015）、黄萎病QTL定位（刘剑光等，2014）等研究，而关于抗黄萎病基因的研究非常少。本课题组前期通过接种黄萎病菌的方法，对棉花不同时期及抗性品种进行了转录组测序，筛选到1个在接种后具有显著差异表达的TPS基因片段，但该基因在棉花抗黄萎病中是否起关键作用仍需深入研究。【拟解决的关键问题】通过克隆GbTPS基因，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对GbTPS基因在浸染黄萎病后进行表达水平分析，研究GbTPS基因在抗病性中的作用，为阐释其分子功能提供参考，并对GbTPS进行病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS），以期为进一步研究该基因的功能打下基础。 1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试高抗黄萎病海岛棉（Gossypium barbadense）品种新海15由中国农业科学院安阳棉花研究所提供；黄萎病菌菌种（Verticillium dahlia）由河南省植物逆境生物学重点实验室提供。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 总RNA抽提 播种前剪掉种壳顶端，将种子于清水中浸泡5～6 h后，放置于铺有湿润棉花的培养皿中，覆盖一层湿润的棉花，放置于培养箱中等待萌发。次日将已出芽的棉花种子播种于边长为7 cm的花盆（土∶蛭石∶营养土=2∶1∶1）中，置于光照培养箱中培养（25 ℃，L∶D=16 h∶8 h）。
待幼苗长至2片真叶时，通过伤根处理，接种浓度为1×107 N/L的黄萎病菌，并于接种后24 h取叶片，通过无菌水清洗后，参考EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒（艾德莱公司）进行RNA抽提，并将检测合格的样品置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。
1. 2. 2 GbTPS基因克隆 利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒对总RNA进行反转录，获得单链cDNA，体系为：RNA 3.0 μL，Oligo（dT）2.0 μL，DEPC水8.0 μL，70 ℃ 10 min；RNase 0.5 μL，M-MLV反转录酶1.0 μL，5×Buffer 5.0 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，DEPC水3.5 μL，42 ℃ 90 min，72 ℃ 10 min。设计引物GbTPS-F和GbTPS-R对该基因进行扩增（表1），引物设计原则为上、下游引物分别位于该基因开放阅读框的两端，且尽量保证两条引物的长度、退火温度相差不明显，尽量避免引物二聚体结构的出现，引物由华大基因合成。
GbTPS基因的PCR反应体系50.0 μL，包括5×Trans Start Fast Pfu Fly Buffer 10.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 5.0 μL、上游引物（GbTPS-F）和下游引物（GbTPS-R）各1.0 μL、DNA聚合酶（Trans Start Fast Pfu Fly DNA polymerase）1.0 μL、cDNA模板1.0 μL，用ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物胶回收后连接至pMD18-T载体并送华大基因测序。
1. 2. 3 基因生物信息学分析 编码氨基酸序列的预测、叶绿体转运肽、等电点和分子质量等分别通过Translate tool（http：//web.expasy.org/translate/）、ChloroP
1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）、Gneneva大学的ExPASy服务器（http：//μs.expasy.org/
tools/protparam.html）进行分析。使用ClustalX 2.0进行多重序列比对，运用MEGA 3.1基于Neighbour-joining方法构建系统发育进化树。
1. 2. 4 qRT-PCR分析 待棉花苗长到2叶1心时，参考蘸根法进行黄萎病的浸染，分别将浸染过和未浸染过的棉花苗在以下时间点取样：0、1、4、8、12、24、36、48和72 h。参考1.2.1和1.2.2的方法提取RNA并反转录获得cDNA。
使用引物qGbTPS-F和qGbTPS-R进行PCR检测，以UBQ7为内参，引物序列见表1。反应体系10.0 μL：含SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）5.0 μL，上、下游引物各0.3 μL，ROX Ⅱ 0.2 μL，cDNA模板3.0 μL，ddH2O 1.2 μL。试验设3次重复，使用ABI 7300荧光定量PCR仪的默认程序进行检测，结果使用公式2-△△Ct进行计算。
1. 2. 5 VIGS载体pTRV-GbTPS构建 使用引物GbTPS-
F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）扩增GbTPS基因的部分片段用于构建VIGS载体。
PCR反应体系：Ex Taq Version 2.0 Plus dye（Premix Taq）10.0 μL，引物GbTPS-F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，加8.0 μL ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。
上述扩增获得的PCR产物和pTRV（由棉花生物学国家重点实验室保存）分别使用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切，回收目的片段进行连接并转化大肠杆菌，测序验证获得阳性载体命名为pTRV-GbTPS，将其转化农杆菌（GV3101）备用。转化农杆菌方法：取100 μL农杆菌感受态于冰上静置，待其溶化，加入1 μL pTRV-GbTPS质粒轻轻混合均匀，冰浴30 min后于液氮中速冻70 s，再迅速放入37 ℃水浴中保持5～6 min，于超净工作台中加入1 mL新鲜空白LB液体培养基，28 ℃下180 r/min摇床培养4 h，4000 r/min离心5 min，吸去500 μL LB液体培养基，悬浮菌体，涂布于含有相应抗生素（卡那+庆大霉素/利福平）的培养基上，28 ℃倒置培养2～3 d。
1. 2. 6 GbTPS基因沉默 取pTRV-GbTPS和pTRV1、pTRV2（空载体）、Cla农杆菌于含庆大霉素、卡那霉素、MES（10 mmol/L）和AS（15 μmol/L）的液体LB培养基培养至OD600为0.6～0.8时，收集菌体并浮于等体积浸染液，浸染液成分及其终浓度为：MES（10 mmol/L）、AS（150 μmol/L）、MgCl2（10 mmol/L）。将pTRV1与pTRV-GbTPS、pTRV2（空载体）及Cla农杆菌悬浮液以1∶1的比例混合。 待培养的幼苗长到1叶（真叶）1心阶段，选择长势良好的棉花苗进行注射，于25 ℃培养箱中遮光处理24 h后正常培养。
1. 2. 7 黄萎病菌浸染 VIGS处理的棉花幼苗生长到2叶1心时，参考蘸根法将幼苗从培养盆里取出（Cla农杆菌处理的幼苗除外），伤根后浸入黄萎病菌液中40 s并重新移栽到培养盆中，浇水并放回光照培养箱中培养。参考早（苗）期鉴定黄萎病发病程度的分级标准，适时观察发病情况，统计病情指数。
1. 2. 8 GbTPS基因半定量RT-PCR分析 如上VIGS处理的棉花幼苗生长到2叶1心时，处理组（pTRV- GbTPS）和对照组（pTRV2）分别取3～4片第2真叶提取RNA，逆转录成cDNA后进行半定量PCR。使用引物GbTPS-F（VIGS）和GbTPS-R（VIGS），其反应体系为：Ex Taq Version 2.0 Plus dye（Premix Taq）10.0 μL，引物GbTPS-F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，加ddH2O补足至20.0 μL。反应程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。
2 结果与分析
2. 1 GbTPS基因克隆
通过PCR扩增得到约1700 bp的条带（图1），测序后该基因全长为1761 bp，与预期的棉花萜类合成酶基因一致，命名为GbTPS（GenBank登录号：KP247548）。
2. 2 GbTPS蛋白质序列的生物信息学分析
2. 2. 1 预测氨基酸序列的理化性质分析 通过生物信息学分析发现，GbTPS基因编码586个氨基酸序列；其分子质量为67.7 kD，等电点为5.79，氨基酸N'端转运肽分析结果如表2所示：GbTPS含有叶绿体转运肽，主要定位于叶绿体。
2. 2. 2 GbTPS蛋白的多序列列队分析 多序列比对结果（图2）显示，GbTPS蛋白与其他蛋白序列一样，也具有“DDxxD”、（N，D）D（L，I，V）x（S，T）xxxE和LQLYEASFLL保守序列，但缺少“RRx8R”基序，具有TPS家族典型的保守序列特征。其氨基酸N'端均有一段叶绿体转运肽，这些特征均是植物单萜合酶的典型特征。因此，推测GbTPS可能是海岛棉中的单萜合酶。
2. 2. 3 GbTPS蛋白的进化分析 GbTPS蛋白的系统进化树分析结果（图3）表明，萜类合酶共有7个亚家族分支，分别为Tps-a、Tps-b、Tps-c、Tps-d、Tps-e、Tps-f和Tps-g，克隆得到萜類合酶GbTPS与拟南芥芳樟醇合成酶聚类到一个分支上，同属于萜类合酶Tps-g亚家族，进一步证明该基因是海岛棉中一个单萜合酶基因，合成的单萜为非环状单萜，易挥发。
2. 3 GbTPS基因的qRT-PCR表达模式分析
qRT-PCR检测GbTPS在被黄萎病浸染后不同时间点的转录水平的表达量，为消除黄萎病浸染时伤根处理对棉花根部造成的影响，以进行同样伤根处理但并未浸染黄萎病的健康苗作为对照。
空白对照组与试验组均以UBQ7基因作为内标，且分别以各自0 h时期的表达量作为参照因子，图4为各时间点对照组与试验组中GbTPS基因的表达量，结果显示：GbTPS基因的表达量在接种后呈升高—降低—升高—降低的波动趋势，在4～24 h内其表达水平显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于对照组，之后其表达量便低于对照组，且在72 h时与对照组表达水平几乎一致。
2. 4 GbTPS基因的VIGS诱导结果
对试验组（pTRV-GbTPS）和对照组（pTRV2）所取的真叶样品分别提取RNA反转录得到cDNA后进行PCR检测，结果如图5所示。由图5可看出，对照组能检测到目的基因，而试验组中目的基因的表达量几乎检测不到，表明GbTPS基因已被沉默。
在VIGS处理幼苗经黄萎病菌侵染后，统计其黄萎病的发病情况，结果如图6所示。被干涉掉Cla基因的棉花苗出现白化症状（图6-A），进一步证明其干涉效果良好。从图6-B可看出，试验组和对照组均出现发病症状，由试验组和对照组整体发病情况的对比（图6-C）可以看出，其结果并无明显差异。根据病情指数统计结果（表3）显示，试验组的病情指数与空白对照组无明显差别，说明该基因的沉默并未对棉花的发病情况造成影响。
3 讨论
单萜化合物在棉花抗黄萎病过程中发挥重要作用。单萜为C10类萜类化合物，含有保守性结构域“DDXD”，该结构域位于活性位点的入口处，具有结合二价金属阳离子（如Mg2+）的功能（Sacchettni and Poulter，1997）；此外，植物的单萜合酶还具有“RRx8R”保守域和叶绿体转运肽（Aubourg et al.，2002）。萜类合酶均起源于古萜类合酶，根据其同一亚家族的不同氨基酸序列间至少有40%一致性的标准，将其分为7个亚家族（Tps-a～Tps-g）（Bohlmann et al.，1998），其中Tps-b、Tps-d、Tps-f和Tps-g 4个亚家族包含单萜合酶，Tps-a亚家族包含倍半萜合酶和二萜合酶（Chen et al.，2011）。通过生物信息学分析，本研究克隆得到的GbTPS基因编码氨基酸序列具有“DDxxD”和叶绿体转运肽等单萜所特有的保守结构域，同时也含有LQLYEASFLL、DDxxD和xxSxxxE等萜类共有的保守结构域，表明该基因为典型的单萜合酶基因。通过ClustalX 2.0进行序列对比，MEGA 3.1进行系统发育进化树分析，其结果表明该基因与拟南芥芳樟醇合成酶同属于Tps-g亚家族。
本研究的qRT-PCR结果表明，GbTPS基因的表达量呈升高—降低—升高—降低的波动趋势，与前人报道萜类释放具有节律性的结果一致（Rohdichet al.，2005；Withers and Keasling，2007），且该节律性受对应的萜类合成酶的调控。棉花在浸染黄萎病后1 h内表达量低于对照组，在4～24 h内表达量显著或极显著高于对照组，之后又低于对照组，且在72 h时其表达量几乎与对照组无差别，表明4～24 h内该基因受黄萎病诱导显著上调，且在感染黄萎病的1 h内及24 h后其表达受到抑制，故推测该基因在棉花感染黄萎病菌后的4～24 h内可能具有抗病作用。VIGS处理结果表明，缺失GbTPS基因的棉花在浸染黄萎病后其发病情况与对照组相比并无明显差异，结合qRT-PCR结果，表明GbTPS基因可能只在棉花感染黄萎病菌的初期具有抗病作用。本研究对GbTPS基因的抗黄萎病性进行了初步探索，后续研究将定位于棉花感染黄萎病的初期阶段。 4 结论
本研究结果表明，海岛棉单萜合成酶基因GbTPS仅在棉花抗黄萎病的早期发挥积极作用。
参考文献：
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（責任编辑 王 晖）
关键词： 棉花；单萜合酶；GbTPS基因；黄萎病；实时荧光定量PCR
中图分类号： S562；Q344 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0604-07
Abstract：【Objective】A monoterpene synthetase gene GbTPS was cloned from Gossypiumbar badense， and its expression induced by Verticillium wilt were analysed， in order to lay a foundation for studying resistance of cotton to Verticillium wilt. 【Method】The full-length open reading frame（ORF） of GbTPS gene was cloned， and its encoded protein was analysed by bioinformatics， the real-time fluorescent quantitative PCR（qRT-PCR） and virus induced gene silencing was used to analyse resistance to Verticillium wilt. 【Result】Full-length ORF was obtained， with length of 1761 bp， and named GbTPS（Genebank accession number： KP247548）. The bioinformatics analysis showed that， the protein composed of 586 amino acids was coded by GbTPS gene， its predicted molecular weight was 67.7 kD， its isoelectric point was 5.79. Phylogenetic tree analysis showed that， GbTPS belonged to Tps-g subfamily. The expression of GbTPS gene was significant（P<0.05） or extermely significant（P<0.01） higher than that of blank control within 4-24 h after being induced by Verticillium dahlia. The disease index of virus induced gene silencing was 52.38， and had no significant difference with that of control. 【Conclusion】Only at the early stage， the GbTPS gene plays a positive role in resistance to cotton Verticillium wilt.
Key words： cotton； monoterpene synthase； GbTPS gene； Verticillium wilt； qRT-PCR
0 引言
【研究意義】棉花是一种重要的经济作物，在我国乃至世界的经济发展中有着重要地位，是棉制品和服装的重要材料来源，但生产中易受黄萎病菌的侵害而导致大量减产。萜类化合物是植物中种类最多的一类天然烃类化合物，又名类异戊二烯。目前，已分离到的萜类达4万多种（胡永健等，2007）。植物中的萜类化合物包括初生代谢物和次生代谢物，其中次生代谢萜类化合物具有抗病虫害的重要作用。随着分子生物学的发展，萜类合成的关键酶及其在防御作用中的分子机理逐渐成为植物防御研究中的热点之一。萜类合成酶（Terpene Synthases，TPS）是萜类合成过程中的关键酶，也是棉花抗黄萎病过程中的一种重要酶，如δ杜松烯合成酶是合成棉花抗毒素的关键酶（Tan et al.，2000）。抗病基因在抗病过程中起着识别病原菌和开启抗病信号途径的重要作用，而萜类合成酶受萜类合成酶基因的调控。因此，研究萜类合成酶的相关基因是研究萜类化合物抗病性的关键。【前人研究进展】Mace等（1985）在研究萜类物质的过程中发现，脱氧半棉酚对黄萎病菌的抗性优于脱氧半棉酚甲醚、半棉酚和半棉酚甲醚。Mace等（1989）对感染黄萎病的海岛棉进行基因表达分析，结果发现与萜烯生物合成途径相关的基因均受黄萎病诱导表达。Kawchuk等（2001）从番茄中克隆到Ve1、Ve2两个抗黄萎病基因。Zuo等（2005，2007）在接种黄萎病V991的海岛棉7124中克隆获得2个与乙烯信号传导途径相关的基因（GbERF1和GbERF2），后续研究证明它们可能在海岛棉抗黄萎病的过程中发挥一定作用。【本研究切入点】目前，前人已进行了棉花黄萎病菌致病力分化（林玲等，2005；乔艳艳等，2015）、黄萎病QTL定位（刘剑光等，2014）等研究，而关于抗黄萎病基因的研究非常少。本课题组前期通过接种黄萎病菌的方法，对棉花不同时期及抗性品种进行了转录组测序，筛选到1个在接种后具有显著差异表达的TPS基因片段，但该基因在棉花抗黄萎病中是否起关键作用仍需深入研究。【拟解决的关键问题】通过克隆GbTPS基因，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对GbTPS基因在浸染黄萎病后进行表达水平分析，研究GbTPS基因在抗病性中的作用，为阐释其分子功能提供参考，并对GbTPS进行病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS），以期为进一步研究该基因的功能打下基础。 1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试高抗黄萎病海岛棉（Gossypium barbadense）品种新海15由中国农业科学院安阳棉花研究所提供；黄萎病菌菌种（Verticillium dahlia）由河南省植物逆境生物学重点实验室提供。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 总RNA抽提 播种前剪掉种壳顶端，将种子于清水中浸泡5～6 h后，放置于铺有湿润棉花的培养皿中，覆盖一层湿润的棉花，放置于培养箱中等待萌发。次日将已出芽的棉花种子播种于边长为7 cm的花盆（土∶蛭石∶营养土=2∶1∶1）中，置于光照培养箱中培养（25 ℃，L∶D=16 h∶8 h）。
待幼苗长至2片真叶时，通过伤根处理，接种浓度为1×107 N/L的黄萎病菌，并于接种后24 h取叶片，通过无菌水清洗后，参考EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒（艾德莱公司）进行RNA抽提，并将检测合格的样品置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。
1. 2. 2 GbTPS基因克隆 利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒对总RNA进行反转录，获得单链cDNA，体系为：RNA 3.0 μL，Oligo（dT）2.0 μL，DEPC水8.0 μL，70 ℃ 10 min；RNase 0.5 μL，M-MLV反转录酶1.0 μL，5×Buffer 5.0 μL，10 mmol/L dNTP 2.0 μL，DEPC水3.5 μL，42 ℃ 90 min，72 ℃ 10 min。设计引物GbTPS-F和GbTPS-R对该基因进行扩增（表1），引物设计原则为上、下游引物分别位于该基因开放阅读框的两端，且尽量保证两条引物的长度、退火温度相差不明显，尽量避免引物二聚体结构的出现，引物由华大基因合成。
GbTPS基因的PCR反应体系50.0 μL，包括5×Trans Start Fast Pfu Fly Buffer 10.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 5.0 μL、上游引物（GbTPS-F）和下游引物（GbTPS-R）各1.0 μL、DNA聚合酶（Trans Start Fast Pfu Fly DNA polymerase）1.0 μL、cDNA模板1.0 μL，用ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物胶回收后连接至pMD18-T载体并送华大基因测序。
1. 2. 3 基因生物信息学分析 编码氨基酸序列的预测、叶绿体转运肽、等电点和分子质量等分别通过Translate tool（http：//web.expasy.org/translate/）、ChloroP
1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）、Gneneva大学的ExPASy服务器（http：//μs.expasy.org/
tools/protparam.html）进行分析。使用ClustalX 2.0进行多重序列比对，运用MEGA 3.1基于Neighbour-joining方法构建系统发育进化树。
1. 2. 4 qRT-PCR分析 待棉花苗长到2叶1心时，参考蘸根法进行黄萎病的浸染，分别将浸染过和未浸染过的棉花苗在以下时间点取样：0、1、4、8、12、24、36、48和72 h。参考1.2.1和1.2.2的方法提取RNA并反转录获得cDNA。
使用引物qGbTPS-F和qGbTPS-R进行PCR检测，以UBQ7为内参，引物序列见表1。反应体系10.0 μL：含SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）5.0 μL，上、下游引物各0.3 μL，ROX Ⅱ 0.2 μL，cDNA模板3.0 μL，ddH2O 1.2 μL。试验设3次重复，使用ABI 7300荧光定量PCR仪的默认程序进行检测，结果使用公式2-△△Ct进行计算。
1. 2. 5 VIGS载体pTRV-GbTPS构建 使用引物GbTPS-
F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）扩增GbTPS基因的部分片段用于构建VIGS载体。
PCR反应体系：Ex Taq Version 2.0 Plus dye（Premix Taq）10.0 μL，引物GbTPS-F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，加8.0 μL ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。
上述扩增获得的PCR产物和pTRV（由棉花生物学国家重点实验室保存）分别使用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切，回收目的片段进行连接并转化大肠杆菌，测序验证获得阳性载体命名为pTRV-GbTPS，将其转化农杆菌（GV3101）备用。转化农杆菌方法：取100 μL农杆菌感受态于冰上静置，待其溶化，加入1 μL pTRV-GbTPS质粒轻轻混合均匀，冰浴30 min后于液氮中速冻70 s，再迅速放入37 ℃水浴中保持5～6 min，于超净工作台中加入1 mL新鲜空白LB液体培养基，28 ℃下180 r/min摇床培养4 h，4000 r/min离心5 min，吸去500 μL LB液体培养基，悬浮菌体，涂布于含有相应抗生素（卡那+庆大霉素/利福平）的培养基上，28 ℃倒置培养2～3 d。
1. 2. 6 GbTPS基因沉默 取pTRV-GbTPS和pTRV1、pTRV2（空载体）、Cla农杆菌于含庆大霉素、卡那霉素、MES（10 mmol/L）和AS（15 μmol/L）的液体LB培养基培养至OD600为0.6～0.8时，收集菌体并浮于等体积浸染液，浸染液成分及其终浓度为：MES（10 mmol/L）、AS（150 μmol/L）、MgCl2（10 mmol/L）。将pTRV1与pTRV-GbTPS、pTRV2（空载体）及Cla农杆菌悬浮液以1∶1的比例混合。 待培养的幼苗长到1叶（真叶）1心阶段，选择长势良好的棉花苗进行注射，于25 ℃培养箱中遮光处理24 h后正常培养。
1. 2. 7 黄萎病菌浸染 VIGS处理的棉花幼苗生长到2叶1心时，参考蘸根法将幼苗从培养盆里取出（Cla农杆菌处理的幼苗除外），伤根后浸入黄萎病菌液中40 s并重新移栽到培养盆中，浇水并放回光照培养箱中培养。参考早（苗）期鉴定黄萎病发病程度的分级标准，适时观察发病情况，统计病情指数。
1. 2. 8 GbTPS基因半定量RT-PCR分析 如上VIGS处理的棉花幼苗生长到2叶1心时，处理组（pTRV- GbTPS）和对照组（pTRV2）分别取3～4片第2真叶提取RNA，逆转录成cDNA后进行半定量PCR。使用引物GbTPS-F（VIGS）和GbTPS-R（VIGS），其反应体系为：Ex Taq Version 2.0 Plus dye（Premix Taq）10.0 μL，引物GbTPS-F（VIGS）、GbTPS-R（VIGS）各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，加ddH2O补足至20.0 μL。反应程序：95 ℃预变性4 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。
2 结果与分析
2. 1 GbTPS基因克隆
通过PCR扩增得到约1700 bp的条带（图1），测序后该基因全长为1761 bp，与预期的棉花萜类合成酶基因一致，命名为GbTPS（GenBank登录号：KP247548）。
2. 2 GbTPS蛋白质序列的生物信息学分析
2. 2. 1 预测氨基酸序列的理化性质分析 通过生物信息学分析发现，GbTPS基因编码586个氨基酸序列；其分子质量为67.7 kD，等电点为5.79，氨基酸N'端转运肽分析结果如表2所示：GbTPS含有叶绿体转运肽，主要定位于叶绿体。
2. 2. 2 GbTPS蛋白的多序列列队分析 多序列比对结果（图2）显示，GbTPS蛋白与其他蛋白序列一样，也具有“DDxxD”、（N，D）D（L，I，V）x（S，T）xxxE和LQLYEASFLL保守序列，但缺少“RRx8R”基序，具有TPS家族典型的保守序列特征。其氨基酸N'端均有一段叶绿体转运肽，这些特征均是植物单萜合酶的典型特征。因此，推测GbTPS可能是海岛棉中的单萜合酶。
2. 2. 3 GbTPS蛋白的进化分析 GbTPS蛋白的系统进化树分析结果（图3）表明，萜类合酶共有7个亚家族分支，分别为Tps-a、Tps-b、Tps-c、Tps-d、Tps-e、Tps-f和Tps-g，克隆得到萜類合酶GbTPS与拟南芥芳樟醇合成酶聚类到一个分支上，同属于萜类合酶Tps-g亚家族，进一步证明该基因是海岛棉中一个单萜合酶基因，合成的单萜为非环状单萜，易挥发。
2. 3 GbTPS基因的qRT-PCR表达模式分析
qRT-PCR检测GbTPS在被黄萎病浸染后不同时间点的转录水平的表达量，为消除黄萎病浸染时伤根处理对棉花根部造成的影响，以进行同样伤根处理但并未浸染黄萎病的健康苗作为对照。
空白对照组与试验组均以UBQ7基因作为内标，且分别以各自0 h时期的表达量作为参照因子，图4为各时间点对照组与试验组中GbTPS基因的表达量，结果显示：GbTPS基因的表达量在接种后呈升高—降低—升高—降低的波动趋势，在4～24 h内其表达水平显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于对照组，之后其表达量便低于对照组，且在72 h时与对照组表达水平几乎一致。
2. 4 GbTPS基因的VIGS诱导结果
对试验组（pTRV-GbTPS）和对照组（pTRV2）所取的真叶样品分别提取RNA反转录得到cDNA后进行PCR检测，结果如图5所示。由图5可看出，对照组能检测到目的基因，而试验组中目的基因的表达量几乎检测不到，表明GbTPS基因已被沉默。
在VIGS处理幼苗经黄萎病菌侵染后，统计其黄萎病的发病情况，结果如图6所示。被干涉掉Cla基因的棉花苗出现白化症状（图6-A），进一步证明其干涉效果良好。从图6-B可看出，试验组和对照组均出现发病症状，由试验组和对照组整体发病情况的对比（图6-C）可以看出，其结果并无明显差异。根据病情指数统计结果（表3）显示，试验组的病情指数与空白对照组无明显差别，说明该基因的沉默并未对棉花的发病情况造成影响。
3 讨论
单萜化合物在棉花抗黄萎病过程中发挥重要作用。单萜为C10类萜类化合物，含有保守性结构域“DDXD”，该结构域位于活性位点的入口处，具有结合二价金属阳离子（如Mg2+）的功能（Sacchettni and Poulter，1997）；此外，植物的单萜合酶还具有“RRx8R”保守域和叶绿体转运肽（Aubourg et al.，2002）。萜类合酶均起源于古萜类合酶，根据其同一亚家族的不同氨基酸序列间至少有40%一致性的标准，将其分为7个亚家族（Tps-a～Tps-g）（Bohlmann et al.，1998），其中Tps-b、Tps-d、Tps-f和Tps-g 4个亚家族包含单萜合酶，Tps-a亚家族包含倍半萜合酶和二萜合酶（Chen et al.，2011）。通过生物信息学分析，本研究克隆得到的GbTPS基因编码氨基酸序列具有“DDxxD”和叶绿体转运肽等单萜所特有的保守结构域，同时也含有LQLYEASFLL、DDxxD和xxSxxxE等萜类共有的保守结构域，表明该基因为典型的单萜合酶基因。通过ClustalX 2.0进行序列对比，MEGA 3.1进行系统发育进化树分析，其结果表明该基因与拟南芥芳樟醇合成酶同属于Tps-g亚家族。
本研究的qRT-PCR结果表明，GbTPS基因的表达量呈升高—降低—升高—降低的波动趋势，与前人报道萜类释放具有节律性的结果一致（Rohdichet al.，2005；Withers and Keasling，2007），且该节律性受对应的萜类合成酶的调控。棉花在浸染黄萎病后1 h内表达量低于对照组，在4～24 h内表达量显著或极显著高于对照组，之后又低于对照组，且在72 h时其表达量几乎与对照组无差别，表明4～24 h内该基因受黄萎病诱导显著上调，且在感染黄萎病的1 h内及24 h后其表达受到抑制，故推测该基因在棉花感染黄萎病菌后的4～24 h内可能具有抗病作用。VIGS处理结果表明，缺失GbTPS基因的棉花在浸染黄萎病后其发病情况与对照组相比并无明显差异，结合qRT-PCR结果，表明GbTPS基因可能只在棉花感染黄萎病菌的初期具有抗病作用。本研究对GbTPS基因的抗黄萎病性进行了初步探索，后续研究将定位于棉花感染黄萎病的初期阶段。 4 结论
本研究结果表明，海岛棉单萜合成酶基因GbTPS仅在棉花抗黄萎病的早期发挥积极作用。
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（責任编辑 王 晖）