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【摘要】 目的 探讨糖原合成酶（GYS1）对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测正常人支气管上皮样细胞系HBE细胞和非小细胞肺癌细胞系NCI-H661、NCI-H1299中GYS1 mRNA相对表达量。过表达NCI-H1299细胞的GYS1，构建GYS1过表达细胞模型，采用MTT增殖实验、EdU增殖实验评估细胞的增殖能力，应用平板克隆形成实验评估细胞的克隆形成能力。结果 人非小细胞肺癌细胞NCI-H661、NCI-H1299中GYS1 mRNA的表达水平高于人正常支气管上皮样细胞HBE的表达水平（P均< 0.001）。NCI-H1299-GYS1过表达细胞的GYS1 mRNA和蛋白相对表达量均上调（P均< 0.001）。过表达GYS1促进了NCI-H1299细胞的增殖和克隆形成（P均< 0.001）。结论 GYS1在非小细胞肺癌中高表达，过表达GYS1促进了非小细胞肺癌细胞的增殖。
【关键词】 非小细胞肺癌;糖原合成酶1;增殖
Effect of overexpression of glycogen synthase 1 on the proliferation of non-small cell lung cancer cells Huang Wenfei， Zhang Zhihai， Tan Huifeng， Li Yingmei， Lu Yangyi， Chen Jiaxin. Department of Respiratory， Nanhai Hospital of Guangdong Provincial People’s Hospital， Foshan 528200， China
Corresponding author， Chen Jiaxin， E-mail： jxchenmd@ 163. com
【Abstract】 Objective To evaluate the effect of glycogen synthase 1 （GYS1） on the proliferation of non-small cell lung cancer cells. Methods The relative expression levels of GYS1 mRNA in normal human bronchial epithelial cell line HBE cells， non-small cell lung cancer cell lines NCI-H661 and NCI-H1299 were quantitatively detected by quantitative real-time fluorescence PCR （qRT-PCR）. The NCI-H1299 cells overexpressing GYS1 were utilized to establish the GYS1 overexpression cell model. MTT assay and EdU proliferation experiment were adopted to evaluate the cell proliferation ability， and plate clone formation assay was employed to assess the cell clone formation ability. Results The expression levels of GYS1 mRNA in human non-small cell lung cancer cells NCI-H661 and NCI-H1299 were significantly higher than that in normal human bronchial epithelial cell HBE （both P < 0.001）. The relative expression levels of GYS1 mRNA and protein were significantly up-regulated in the NCI-H1299-GYS1 overexpressing cells （both P < 0.001）. Overexpression of GYS1 remarkably promoted the proliferation and clone formation of NCI-H1299 cells （both P < 0.001）. Conclusions GYS1 is highly expressed in non-small cell lung cancer. Overexpression of GYS1 promotes the proliferation of non-small cell lung cancer cells.
【Key words】 Non-small cell lung cancer;Glycogen synthase 1;Proliferation
肺癌是人類健康的主要威胁之一，据估计2018年全球肺癌死亡人数达到180万[1]。肺癌的病理学类型常见非小细胞肺癌和小细胞肺癌。85%的肺癌为非小细胞肺癌，大多数患者在发现时已处于中晚期，失去了手术机会[2]。非小细胞肺癌发生发展关键驱动基因的深入研究，对患者和临床医师而言具有重要的意义。
代谢紊乱是许多肿瘤的特征。肿瘤对其代谢产物进行重新编程，以产生足够的能量维持生存。糖原主要储存在肌肉和肝脏中，在需要时作为能量供应。然而，非小细胞肺癌糖原代谢的改变及其分子机制仍然有待于进一步研究。糖原合成的关键酶之一糖原合成酶（GYS）包括2种亚型，即GYS1和GYS2。GYS1通常在肌肉、肺、心脏和肾脏中表达，而GYS2主要局限于肝脏[3]。研究表明，GYS1在缺氧条件下被迅速诱导，并与胶质母细胞瘤、乳腺癌和结肠癌细胞系中的糖原积累呈正相关[4]。GYS1的异常表达不仅降低了细胞糖酵解，而且增加了糖原反应性AMP激酶的激活，导致髓系白血病细胞的生长抑制[5]。然而，GYS1在非小细胞肺癌中的作用尚不明确，仍然有待于进一步研究。本研究旨在阐明GYS1在非小细胞肺癌细胞糖原代谢和增殖中的作用。 材料与方法
一、主要材料
正常人支气管上皮样细胞系HBE和人非小细胞肺癌细胞系NCI-H661、NCI-H1299购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。主要试剂包括青霉素-链霉素双抗（HyClone， 美国），Opti-MEM培养基（Thermo Fisher Scientific， 美国），Lipofectamine 3000 （Lip 3000，Invitrogen， 美国），MTT（碧云天，中国），DMEM培养基（Gibco， 美国）;TRIzol试剂（BIOO Scientific， 美国），逆转录试剂（维诺赞， 中国），定量PCR试剂（Takara， 中国），RIPA裂解液（碧云天， 中国），二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（碧云天， 中國）;GYS1抗体（1∶1000， CST， 美国）;β-actin抗体（1∶2000， Santa Cruz Biotechnology， 美国）。
二、方 法
1. 细胞培养
HBE正常人支气管上皮样细胞和NCI-H661、NCI-H1299人非小细胞肺癌细胞采用含胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（1∶9）进行细胞培养，培养基中均含有100 μg/ml的链霉素和青霉素。取对数生长期的细胞用于实验。细胞培养箱条件设置为37℃、5% CO2。
2. 细胞转染
转染空载体质粒的NCI-H1299细胞为Vector组，转染GYS1重组质粒的NCI-H1299细胞为GYS1组;细胞转染的前1日，常规消化细胞并收集，离心洗涤1遍，制成单细胞悬液，计数后接种于24孔板（Corning， 美国）中，每孔细胞数1×105个;细胞转染当日，取Opti-MEM转染专用培养基稀释质粒，移液枪吹打;加入Lip 3000，应用移液枪轻轻吹打，等待20 min;取Lip 3000在Opti-MEM中稀释，移液枪轻轻吹打;取出前1日铺板的细胞，将混合液加入对应各孔中，“8”字摇晃混匀;37℃、5% CO2培养条件继续进行细胞培养，48 h后检测GYS1 mRNA的表达，72 h后检测GYS1蛋白的表达。
3. 实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测
应用TRIzol RNA提取试剂从GYS1过表达组和Vector组细胞中获取总RNA，然后逆转录、qRT-PCR检测mRNA表达水平。反应体系包括5 μl的SYBR premix（2倍稀释）、2 μl的cDNA模板、1 μl的混合引物（上下游引物提前混合，减少上样误差）、2 μl的DEPC水，震荡混匀。反应条件如下：95℃预变性30 s，95 ℃变性30 s，然后60℃退火20 s，40个循环，72℃延伸30 s。β-actin上游引物序列5’-GAAGCTAAGTCCTGCCCTCA-3’，下游引物序列5’-CAGTGAGGACCCTGGATGTG-3’，qRT-PCR产物长度为305 bp;GYS1上游引物序列5’-C AGCGCGGACCAACAATTTC-3’，下游引物序列5’-TCCTCCCGAACTTTTCCTTCA-3’，qRT-PCR产物长度为3474 bp。用2-△△Ct法分析基因的相对表达量，实验重复3次，结果取平均值。
4. 蛋白免疫印迹法检测
首先用预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤Vector组和GYS1过表达组细胞1次，向6孔板中加入200 μl RIPA裂解液裂解细胞20 min，使裂解液充分接触细胞，每10 min摇匀1次;蛋白浓度测定应用BCA法;按比例加载样缓冲液金属浴95℃蛋白变性5 min;SDS-PAGE电泳分离蛋白质;0.22 μm PVDF膜转膜;5%牛奶封闭1 h;
双蒸水清洗膜;加入一抗抗体（GYS1， 1∶1000;β-actin， 1∶2000）4℃过夜（最少16 h）;次日TBST洗膜液洗涤3遍，每次8 min;弃掉TBST洗膜液，加入二抗，室温孵育1 h;TBST洗膜液洗涤3次，每次8 min;电化学发光（ECL）法曝光成像;结果用Gelpro软件进行分析。
5. MTT检测
使用二甲基亚砜（DMSO）溶解MTT粉末配成终浓度为5 mg/ml的MTT溶液，-20℃避光保存，使用时室温溶解。取GYS1过表达组和对照（Vector）组细胞，制成单细胞悬液，96孔板铺板，每孔加入5×103个细胞，每组4个复孔;周围一圈加PBS;然后分别于检测时间点（24、48、72、96 h），取出96孔板，每孔加入10 μl的MTT工作液，培养箱继续培养4 h;然后每孔加入100 μl的Formazan溶液溶解;在570 nm处测定吸光度（OD值）。
6. EdU增殖实验
按照说明书采用EdU法检测细胞增殖。细胞置于24孔板中培养24 h，加入100 μl EdU，用DAPI染色细胞核。荧光显微镜拍照并计数。实验重复3次。
7. 克隆形成实验
取Vector组和GYS1过表达组的细胞以1×103个/孔的细胞密度接种于6孔板;继续培养7 ～ 14 d;多聚甲醛固定后结晶紫染色;用自来水洗涤细胞，拍照并计数，实验重复3次，结果取平均值。
三、统计学处理
实验数据采用GraphPad Prism 8软件进行数据处理和制图，计量资料采用表示，2组间比较采用独立样本t检验，NCI-H661、NCI-H1299的GYS1 mRNA相对表达量与HBE细胞间GYS1 mRNA的比较先采用单因素方差分析，差异有统计学意义后采用Dunnet-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、GYS1在人非小细胞肺癌细胞中的表达
qRT-PCR检测了正常人支气管上皮样细胞系HBE和非小细胞肺癌细胞系NCI-H661、NCI-H1299中GYS1 mRNA相对表达量，结果显示3种细胞中GYSI mRNA相对表达量比较差异有统计学意义（F = 923.11，P < 0.001），其中NCI-H661（Dunnet-t = 25.17，P < 0.001）、NCI-H1299（Dunnet-t = 43.73，P < 0.001）的GYS1 mRNA相对表达量均高于HBE细胞，见图1。
【关键词】 非小细胞肺癌;糖原合成酶1;增殖
Effect of overexpression of glycogen synthase 1 on the proliferation of non-small cell lung cancer cells Huang Wenfei， Zhang Zhihai， Tan Huifeng， Li Yingmei， Lu Yangyi， Chen Jiaxin. Department of Respiratory， Nanhai Hospital of Guangdong Provincial People’s Hospital， Foshan 528200， China
Corresponding author， Chen Jiaxin， E-mail： jxchenmd@ 163. com
【Abstract】 Objective To evaluate the effect of glycogen synthase 1 （GYS1） on the proliferation of non-small cell lung cancer cells. Methods The relative expression levels of GYS1 mRNA in normal human bronchial epithelial cell line HBE cells， non-small cell lung cancer cell lines NCI-H661 and NCI-H1299 were quantitatively detected by quantitative real-time fluorescence PCR （qRT-PCR）. The NCI-H1299 cells overexpressing GYS1 were utilized to establish the GYS1 overexpression cell model. MTT assay and EdU proliferation experiment were adopted to evaluate the cell proliferation ability， and plate clone formation assay was employed to assess the cell clone formation ability. Results The expression levels of GYS1 mRNA in human non-small cell lung cancer cells NCI-H661 and NCI-H1299 were significantly higher than that in normal human bronchial epithelial cell HBE （both P < 0.001）. The relative expression levels of GYS1 mRNA and protein were significantly up-regulated in the NCI-H1299-GYS1 overexpressing cells （both P < 0.001）. Overexpression of GYS1 remarkably promoted the proliferation and clone formation of NCI-H1299 cells （both P < 0.001）. Conclusions GYS1 is highly expressed in non-small cell lung cancer. Overexpression of GYS1 promotes the proliferation of non-small cell lung cancer cells.
【Key words】 Non-small cell lung cancer;Glycogen synthase 1;Proliferation
肺癌是人類健康的主要威胁之一，据估计2018年全球肺癌死亡人数达到180万[1]。肺癌的病理学类型常见非小细胞肺癌和小细胞肺癌。85%的肺癌为非小细胞肺癌，大多数患者在发现时已处于中晚期，失去了手术机会[2]。非小细胞肺癌发生发展关键驱动基因的深入研究，对患者和临床医师而言具有重要的意义。
代谢紊乱是许多肿瘤的特征。肿瘤对其代谢产物进行重新编程，以产生足够的能量维持生存。糖原主要储存在肌肉和肝脏中，在需要时作为能量供应。然而，非小细胞肺癌糖原代谢的改变及其分子机制仍然有待于进一步研究。糖原合成的关键酶之一糖原合成酶（GYS）包括2种亚型，即GYS1和GYS2。GYS1通常在肌肉、肺、心脏和肾脏中表达，而GYS2主要局限于肝脏[3]。研究表明，GYS1在缺氧条件下被迅速诱导，并与胶质母细胞瘤、乳腺癌和结肠癌细胞系中的糖原积累呈正相关[4]。GYS1的异常表达不仅降低了细胞糖酵解，而且增加了糖原反应性AMP激酶的激活，导致髓系白血病细胞的生长抑制[5]。然而，GYS1在非小细胞肺癌中的作用尚不明确，仍然有待于进一步研究。本研究旨在阐明GYS1在非小细胞肺癌细胞糖原代谢和增殖中的作用。 材料与方法
一、主要材料
正常人支气管上皮样细胞系HBE和人非小细胞肺癌细胞系NCI-H661、NCI-H1299购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。主要试剂包括青霉素-链霉素双抗（HyClone， 美国），Opti-MEM培养基（Thermo Fisher Scientific， 美国），Lipofectamine 3000 （Lip 3000，Invitrogen， 美国），MTT（碧云天，中国），DMEM培养基（Gibco， 美国）;TRIzol试剂（BIOO Scientific， 美国），逆转录试剂（维诺赞， 中国），定量PCR试剂（Takara， 中国），RIPA裂解液（碧云天， 中国），二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（碧云天， 中國）;GYS1抗体（1∶1000， CST， 美国）;β-actin抗体（1∶2000， Santa Cruz Biotechnology， 美国）。
二、方 法
1. 细胞培养
HBE正常人支气管上皮样细胞和NCI-H661、NCI-H1299人非小细胞肺癌细胞采用含胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（1∶9）进行细胞培养，培养基中均含有100 μg/ml的链霉素和青霉素。取对数生长期的细胞用于实验。细胞培养箱条件设置为37℃、5% CO2。
2. 细胞转染
转染空载体质粒的NCI-H1299细胞为Vector组，转染GYS1重组质粒的NCI-H1299细胞为GYS1组;细胞转染的前1日，常规消化细胞并收集，离心洗涤1遍，制成单细胞悬液，计数后接种于24孔板（Corning， 美国）中，每孔细胞数1×105个;细胞转染当日，取Opti-MEM转染专用培养基稀释质粒，移液枪吹打;加入Lip 3000，应用移液枪轻轻吹打，等待20 min;取Lip 3000在Opti-MEM中稀释，移液枪轻轻吹打;取出前1日铺板的细胞，将混合液加入对应各孔中，“8”字摇晃混匀;37℃、5% CO2培养条件继续进行细胞培养，48 h后检测GYS1 mRNA的表达，72 h后检测GYS1蛋白的表达。
3. 实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测
应用TRIzol RNA提取试剂从GYS1过表达组和Vector组细胞中获取总RNA，然后逆转录、qRT-PCR检测mRNA表达水平。反应体系包括5 μl的SYBR premix（2倍稀释）、2 μl的cDNA模板、1 μl的混合引物（上下游引物提前混合，减少上样误差）、2 μl的DEPC水，震荡混匀。反应条件如下：95℃预变性30 s，95 ℃变性30 s，然后60℃退火20 s，40个循环，72℃延伸30 s。β-actin上游引物序列5’-GAAGCTAAGTCCTGCCCTCA-3’，下游引物序列5’-CAGTGAGGACCCTGGATGTG-3’，qRT-PCR产物长度为305 bp;GYS1上游引物序列5’-C AGCGCGGACCAACAATTTC-3’，下游引物序列5’-TCCTCCCGAACTTTTCCTTCA-3’，qRT-PCR产物长度为3474 bp。用2-△△Ct法分析基因的相对表达量，实验重复3次，结果取平均值。
4. 蛋白免疫印迹法检测
首先用预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤Vector组和GYS1过表达组细胞1次，向6孔板中加入200 μl RIPA裂解液裂解细胞20 min，使裂解液充分接触细胞，每10 min摇匀1次;蛋白浓度测定应用BCA法;按比例加载样缓冲液金属浴95℃蛋白变性5 min;SDS-PAGE电泳分离蛋白质;0.22 μm PVDF膜转膜;5%牛奶封闭1 h;
双蒸水清洗膜;加入一抗抗体（GYS1， 1∶1000;β-actin， 1∶2000）4℃过夜（最少16 h）;次日TBST洗膜液洗涤3遍，每次8 min;弃掉TBST洗膜液，加入二抗，室温孵育1 h;TBST洗膜液洗涤3次，每次8 min;电化学发光（ECL）法曝光成像;结果用Gelpro软件进行分析。
5. MTT检测
使用二甲基亚砜（DMSO）溶解MTT粉末配成终浓度为5 mg/ml的MTT溶液，-20℃避光保存，使用时室温溶解。取GYS1过表达组和对照（Vector）组细胞，制成单细胞悬液，96孔板铺板，每孔加入5×103个细胞，每组4个复孔;周围一圈加PBS;然后分别于检测时间点（24、48、72、96 h），取出96孔板，每孔加入10 μl的MTT工作液，培养箱继续培养4 h;然后每孔加入100 μl的Formazan溶液溶解;在570 nm处测定吸光度（OD值）。
6. EdU增殖实验
按照说明书采用EdU法检测细胞增殖。细胞置于24孔板中培养24 h，加入100 μl EdU，用DAPI染色细胞核。荧光显微镜拍照并计数。实验重复3次。
7. 克隆形成实验
取Vector组和GYS1过表达组的细胞以1×103个/孔的细胞密度接种于6孔板;继续培养7 ～ 14 d;多聚甲醛固定后结晶紫染色;用自来水洗涤细胞，拍照并计数，实验重复3次，结果取平均值。
三、统计学处理
实验数据采用GraphPad Prism 8软件进行数据处理和制图，计量资料采用表示，2组间比较采用独立样本t检验，NCI-H661、NCI-H1299的GYS1 mRNA相对表达量与HBE细胞间GYS1 mRNA的比较先采用单因素方差分析，差异有统计学意义后采用Dunnet-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、GYS1在人非小细胞肺癌细胞中的表达
qRT-PCR检测了正常人支气管上皮样细胞系HBE和非小细胞肺癌细胞系NCI-H661、NCI-H1299中GYS1 mRNA相对表达量，结果显示3种细胞中GYSI mRNA相对表达量比较差异有统计学意义（F = 923.11，P < 0.001），其中NCI-H661（Dunnet-t = 25.17，P < 0.001）、NCI-H1299（Dunnet-t = 43.73，P < 0.001）的GYS1 mRNA相对表达量均高于HBE细胞，见图1。