【摘 要】
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RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB,为发光光状杆菌基因敲除提供方法。采用TOPO克隆方法将基因cipA和cipB克隆到质粒pTA上,获得质粒pTA-cipA和pTA-cipB;
【基金项目】
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国家自然基金项目(30700581);国家863项目(2008AA10Z316);中国科学院亚热带农业生态研究所青年人才领域前沿项目(ISACX-LYQY-QN-0701);中国科学院优秀博士学位论文和院长奖获得者科研启动专项资金(0723022110)资助
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RED同源重组法敲除发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB,为发光光状杆菌基因敲除提供方法。采用TOPO克隆方法将基因cipA和cipB克隆到质粒pTA上,获得质粒pTA-cipA和pTA-cipB;采用Red/ET方法分别将Gentar基因和Aprar基因分别插入pTA-cipA和pTA-cipB的cipA和cipB基因中,并替换cipA和cipB基因部分序列,获得pTA-GentaIncipA和pTA-ApraIncipB;pTA-GentaIncipA通过BamHⅠ酶切,从0.7%琼脂糖胶上回收获得GentaIncipA,将GentaIncipA导入带有质粒pASK-αβγA的P.luminescenssubsp.Akhurstii中,通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipA;pTA-ApraIncipB用EcoRⅠ酶切,从0.7%琼脂糖胶上回收获得ApraIncipB,将ApraIncipB导入带有质粒pASK-αβγA的P.luminescenssubsp.Akhurstii中,通过的RED同源重组敲除发光光状杆菌晶体蛋白cipB;42℃下热激去除突变菌中的质粒pASK-αβγA。克隆PCR和SDS-PAGE电泳结果表明发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB均被敲除。采用RED同源重组法成功地敲除了发光光状杆菌晶体蛋白基因cipA和cipB。
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