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摘要 目的：通過高效液相色谱法（HPLC）对二仙汤中淫羊藿黄酮类成分进行含量检测，并采用4个不同产地的淫羊藿进行多角度分析。方法：进样体积为1 μL;色谱柱的的温度控制在40 ℃;流动相A以0.1%色谱纯甲酸和5 mmol/L的色谱纯乙酸铵均匀混合而成;流动相B以色谱纯甲醇和超纯水均匀混合而成，研究中进行所有高效液相色谱线性梯度洗脱程序。检测波长设置在270 nm时可以检测到较多的吸收峰。前期对HPLC进行常规的可靠性方法学考察，包括专属性、精密度、稳定性等，然后进一步对淫羊藿黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C的含量进行检测分析。结果：二仙汤中淫羊藿黄酮类成分淫羊藿苷对照品、淫羊藿次苷Ⅱ对照品、朝藿定B对照品和朝藿定C对照品均可见良好的分离度，且不存在任何内源性的干扰物质，每一个黄酮类成分专属性均较好。淫羊藿苷线性回归方程：Y=34.012X-12.99;淫羊藿次苷Ⅱ线性回归方程：Y=39.875X-7.134;朝藿定B线性回归方程：Y=23.997X-8.416;朝藿定C线性回归方程：Y=29.896X-15.38。淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C精密度试验的RSD值分别为0.33%、0.64%、0.57%、0.52%;稳定性试验RSD值分别为1.09%、1.62%、1.78%、0.41%;重复性试验RSD值分别为2.61%、2.75%、2.48%、1.22%;二仙汤供试品溶液中淫羊藿黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的平均回收率分别为（96.87±2.15）%、（99.46±1.52）%、（101.64±2.43）%、（99.79±2.31）%。二仙汤供试品溶液中淫羊藿黄酮类成分的含量高于淫羊藿单味药材供试品溶液;从淫羊藿不同产地中黄酮类成分含量的角度比较，发现四川产地的淫羊藿中测得的黄酮类成分高于其他3个产地，陕西产地淫羊藿次之，其后为湖北产地淫羊藿，而湖南产地淫羊藿黄酮类成分含量最低。结论：采用HPLC检测二仙汤中淫羊藿黄酮类成分含量具有良好的可靠性，且二仙汤供试品溶液中淫羊藿黄酮类成分的含量高于淫羊藿单味药材供试品溶液。
关键词 高效液相色谱法;二仙汤;淫羊藿苷;淫羊藿次苷Ⅱ;朝藿定B;朝藿定C
Abstract Objective：To determine the content of epimedium flavonoids in Erxian Decoction by high performance liquid chromatography（HPLC），and to analyze Herba Epimedii from 4 different habitats.Methods：Sample volume was 1 μL; column temperature was controlled at 40 ℃; mobile phase A was homogeneously mixed with 0.1% pure formic acid and 5 mmol/L pure ammonium acetate; mobile phase B was homogeneously mixed with pure methanol and ultra-pure water.Linear gradient elution procedures of high performance liquid chromatography were studied.When the detection wavelength was set at 270 nm，more absorption peaks can be detected.In the early stage，the routine reliability methodologies of HPLC were investigated，including specificity，precision，stability，etc.Then the contents of icariin，icariin II，Icariin B，Icariin C were further determined and analyzed.Results：1）Icariin，Icariin II，Chaohoding B and Chaohoding C in Erxian Decoction showed good isolation，and there was no endogenous interfering substance.Each flavonoid had good specificity. 2）The results of linear regression analysis showed that the linear regression equation of icariin was Y=34.012X-12.99; the linear regression equation of icariin II was Y=39.875X-7.134; the linear regression equation of Chaohuoding B was Y=23.997X-8.416; and the linear regression equation of Chaohuoding C was Y=29.896X-15.38. 3）The RSD values of precision tests of icariin，icariin II，Chaixiding B，Chaixiding B，and Chaixiding C were 0.33%，0.64%，0.57%，0.52%.RSD values of stability test were 1.09%，1.62%，1.78%，0.41%.RSD values of repetitive test were 2.61%，2.75%，2.48%，1.22%. 4）The average recoveries of icariin，icariin II，Chaohoding B and Chaohoding C were（96.87±2.15）%，（99.46±1.52）%，（101.64±2.43）%，（99.79±2.31）%，respectively. 5）The content of epimedium flavonoids in Erxian Decoction was higher than that of sample solution of single herb of Herba Epimedii.From the point of view of the content of flavonoids in different habitats of Herba Epimedii，it was found that the content of flavonoids in Herba Epimedii from Sichuan was higher than that in the other 3 habitats，followed by Herba Epimedii from Shaanxi，Herba Epimedii from Hubei，and Herba Epimedii from Hunan.The content of flavonoids was the lowest.Conclusion：The determination of flavonoids in Erxian Decoction by HPLC has good reliability，and the content of flavonoids in Erxian Decoction is higher than that of single herb of Herba Epimedii. Key Words High performance liquid chromatography; Erxian decoction; Icariin; Icariin II; Chaohuding B; Chaohuding C; Content analysis
中图分类号：R289.4;R284 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.006
《中医方剂临床手册》中收录了二仙汤，而这一仅由淫羊藿、仙茅、当归、巴戟天、黄柏、知母组成的药方，是以滋阴温肾与益精降火并重的良方[1]，通过这2个功效对人体进行双重调节，不仅对妇女更年期综合征[2]、性功能减退[3]等有疗效，对骨质疏松症[4-5]，肩周炎[6-7]和老年性失眠[8-9]也有显著的改善作用。二仙汤名字的由来，概其以淫羊藿和仙茅共为君药，而淫羊藿又名仙灵脾，故而命名为二仙汤。仙茅的相关药理研究较多，淫羊藿含有多种黄酮类成分，本研究以二仙汤复方水煎剂和淫羊藿单味药水煎剂，采用高效液相色谱法（HPLC）比较2种不同形式析出的黄酮类成分进行含量测定，比较二仙汤复方水煎剂和淫羊藿单味药水煎剂中黄酮类成分的含量。根据《中华人民共和国药典》淫羊藿中的黄酮类成分较多，本研究主要观察其中最为重要的4中黄酮类成分，分别是淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C[10]。现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器 仪器型号为APS-6080A的高效液相色谱仪购自德国AUPOS科技有限公司（其中恒温箱、自动进样器和荧光检测器的仪器型号分别为：APS-5600、Spark Alias和APS-5600A）;产品型号为CNT SEC-300的色谱柱购自河南奥普斯仪器设备有限公司（孔径：300 ，规格：4.6 mm×150 mm，粒度：5 μm）;产品型号为FA2004B的电子分析天平（读数精度：0.1 mg）购自上海精科天平仪器厂;产品型号为KQ-250DE的台式数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司。
1.2 试药 所有对照品均由上海纯优生物科技有限公司购入，其中淫羊藿苷对照品纯度≥98%（对照药品批号：489-32-7;对照品编号：P0057）、淫羊藿次苷Ⅱ对照品纯度≥95%（对照药品批号：489-32-7;对照品编号：P0057）、朝藿定B对照品纯度≥98%（对照药品批号：110623-73-9;对照品编号：P0355）、朝藿定C对照品纯度≥98%（对照药品批号：110642-44-9;对照品编号：P0356）。HPLC级色谱纯乙腈和HPLC级色谱纯甲醇均购自德国默克（MERCK）公司（药品批号分别为：75-05-8;67-56-1）;HPLC级色谱纯甲酸购自美国飞世尔（FISHER）公司（药品批号：64-18-6）;HPLC级色谱纯甲酸购自美国天地（ACS）公司（药品批号：631-61-8）;本研究中所有的纯净水均由河南中美纯水有限公司提供。
1.3 分析药品 二仙汤：淫羊藿、仙茅、当归、巴戟天均为9 g，黄柏、知母均为6 g。所有药材均由本院药房提供。其中淫羊藿采用4个不同产地的药材，分别为四川、陕西、湖南、湖北。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 进样体积为1 μL;色谱柱的的温度控制在40 ℃;流动相A以0.1%色谱纯甲酸和5 mmol/L的色谱纯乙酸铵均匀混合而成;流动相B以色谱纯甲醇和超纯水均匀混合而成，研究中所有高效液相色谱线性梯度洗脱程序均根据表1进行。检测波长设置在270 nm时可以检测到较多的吸收峰。
2.2 对照品溶液配制 采用精确度为十万分之一的电子分析天平精密分别精密称取淫羊藿苷对照品、淫羊藿次苷Ⅱ对照品、朝藿定B对照品和朝藿定C对照品分别各19.87 mg、19.96 mg、11.65 mg、12.03 mg，分别放置在用标签标记好4个对照品名的10 mL容量瓶中，并用色谱纯甲醇定容至容量瓶刻度，配制成所需质量浓度的单一对照品溶液，最终淫羊藿苷对照品、淫羊藿次苷Ⅱ对照品、朝藿定B对照品和朝藿定C对照品的质量浓度分别为1.987 g/L、1.996 g/L、1.165 g/L、1.203 g/L。将4种对照品溶液混合摇匀后，即得混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液配制
2.3.1 二仙汤供试品溶液配制 根据1.3二仙汤药物组成的配比加入8倍超纯水，煮沸后回流提取浓缩液2 h，分别提取3次后，定容在125 mL的容量瓶中并密闭塞紧瓶盖，后放于超声波中进一步浓缩提取30 min，最后采用孔径只有0.2 μm的有机过滤膜对二仙汤浓缩液进行过滤，所得的续滤液即为二仙汤供试品溶液。
2.3.2 淫羊藿单味药供试品溶液配制 根据1.3二仙汤药物组成中淫羊藿药材的用量，加入8倍超纯水，煮沸后回流提取浓缩液2 h，分别提取3次后，定容在25 mL的容量瓶中并密閉塞紧瓶盖，后放于超声波中进一步浓缩提取30 min，最后采用孔径只有0.2 μm的有机过滤膜对二仙汤浓缩液进行过滤，所得的续滤液即为淫羊藿单味药供试品溶液。
2.3.3 阴性对照溶液配制 根据1.3中除淫羊藿以外的二仙汤药物组成的配比加入8倍超纯水，煮沸后回流提取浓缩液2 h，分别提取3次后，定容在100 mL的容量瓶中并密闭塞紧瓶盖，后放于超声波中进一步浓缩提取30 min，最后采用孔径只有0.2 μm的有机过滤膜不含淫羊藿的二仙汤浓缩液进行过滤，所得的续滤液即为阴性对照供试品溶液。
2.4 专属性试验 采用HPLC对混合对照品溶液、阴性对照供试品溶液、淫羊藿单味药供试品溶液和二仙汤供试品溶液进行专属性试验，本研究结果显示，二仙汤中淫羊藿黄酮类成分淫羊藿苷对照品、淫羊藿次苷Ⅱ对照品、朝藿定B对照品和朝藿定C对照品均可见良好的分离度，最重要的是这4种成分之间并不存在任何内源性的干扰物质，显示各个成分的专属性均较好。见图1。 2.5 线性关系考察 根据对照品溶液配制方法将淫羊藿苷对照品、淫羊藿次苷Ⅱ对照品、朝藿定B对照品和朝藿定C对照品溶液分别根据从低浓度到高浓度的梯度，配制6个浓度梯度的对照品溶液，每个浓度均测试3次，记录色谱峰面积并计算平均值和绘制回归方程，方程中纵坐标Y是各对照品的平均峰面积，横坐标X是各对照品对应的浓度梯度，结果显示淫羊藿苷对照品、淫羊藿次苷Ⅱ对照品、朝藿定B对照品和朝藿定C对照品溶液线性关系考察均显示良好。见表2。
2.6 精密度试验 取同一批次同一时间配制的二仙汤供试品溶液，连续进样6次，检测淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并换算其各自对应的RSD值，结果显示这4个黄酮类成分的RSD值分别为0.33%、0.64%、0.57%、0.52%，符合当RSD值小于3%时，即说明高效液相色谱仪器的精密度良好。见表3。
2.7 稳定性试验 选择同一份二仙汤供试品溶液，根据静置时间的从短到长（0、2、4、8、12、24 h）依次检测二仙汤中黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并换算各成分的RSD值，结果显示这4个黄酮类成分的RSD值分别为1.09%、1.62%、1.78%、0.41%，符合当RSD值小于3%时，即说明二仙汤供试品溶液在静置24 h内都能保持良好的稳定性。见表4。
2.8 重复性试验 取6份同一批次同一制备方法制备的二仙汤供试品溶液，使用同一臺高效液相色谱仪器重复测试该供试品溶液，检测二仙汤中黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并换算各成分的RSD值，结果显示这4个黄酮类成分的RSD值分别为2.61%、2.75%、2.48%、1.22%，符合当RSD值小于3%时，即说明二仙汤供试品溶液能够保持良好的重复性。见表5。
2.9 回收率试验 在含量已知的二仙汤供试品溶液6份中，每一份均加入不同量的对照品溶液，混合均匀后，对混合液和各个对照品溶液分别重复检测6次，检测二仙汤供试品溶液中黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的平均回收率，结果显示这4个黄酮类成分的平均回收率分别为（96.87±2.15）%、（99.46±1.52）%、（101.64±2.43）%、（99.79±2.31）%，说明采用HPLC法测定二仙汤供试品溶液中黄酮类成分的含量是可靠的。
2.10 样品检测结果 比较二仙汤供试品溶液和淫羊藿单味药材供试品溶液中黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C这4种黄酮类成分的含量，结果发现二仙汤供试品溶液中淫羊藿黄酮类成分的含量高于淫羊藿单味药材供试品溶液;从淫羊藿不同产地中黄酮类成分含量的角度比较，结果发现四川产地的淫羊藿中测得的黄酮类成分高于其他3个产地，陕西产地淫羊藿次之，其后为湖北淫羊藿产地，而湖南淫羊藿产地黄酮类成分含量最低。见表6。
3 讨论
近年来，二仙汤的相关药理实验研究发现[11-12]，其中淫羊藿含有大量的黄酮类成分，本研究欲通过对淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C等主要黄铜类成分监测并采用HPLC明确各种成分含量，为二仙汤的复方药物质量控制提供更丰富的研究资料。高效液相色谱法作为常用快捷可靠的液相色谱技术，为复杂体系中药复方的药物成分分离分析提供了良好的平台。HPLC的稳定性十分良好[13-15]，本研究结果也证实了这一点，因此本研究采用HPLC测定二仙汤中4种淫羊藿黄酮类成分能够把每次测量的误差降到最低，进一步保障检测结果的准确性，为二仙汤的复方药物质量控制和相关新制剂研究提供高可信度的参考依据。本研究通过比较二仙汤水煎剂和淫羊藿单味药材水煎剂中淫羊藿黄酮类成分含量，结果表明二仙汤中淫羊藿黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C的含量均较淫羊藿单位要从水煎剂高，这4种黄酮类成分的含量以朝藿定C最高，淫羊藿苷次之，接着是淫羊藿次苷Ⅱ，而朝藿定B含量最少。本研究结果阐释在临床上二仙汤水煎剂有效保证了复方中黄酮类成分的含量，能够最大化实现临床疗效。另外，本研究有进一步选择淫羊藿常见的4个不同产地的药材，经过对比，结果发现四川产地的淫羊藿中测得的黄酮类成分高于其他3个产地，陕西产地淫羊藿次之，其后为湖北淫羊藿产地，而湖南淫羊藿产地黄酮类成分含量最低。这4个产地中四川淫羊藿的黄酮类成分含量最高，可能与该产地的地理位置和气候等因素有关。
综上所述，本研究建立的HPLC同时测定二仙汤中淫羊藿黄酮类成分中的4种主要成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C的含量，这一检测方法不仅操作过程简单便捷，而且方法上具有良好的精密度、稳定性和重复性[16-17]，能够指导临床上二仙汤的复方药物质量控制和新药研发提供研究基础。
参考文献
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（2019-03-13收稿 责任编辑：杨觉雄）
关键词 高效液相色谱法;二仙汤;淫羊藿苷;淫羊藿次苷Ⅱ;朝藿定B;朝藿定C
Abstract Objective：To determine the content of epimedium flavonoids in Erxian Decoction by high performance liquid chromatography（HPLC），and to analyze Herba Epimedii from 4 different habitats.Methods：Sample volume was 1 μL; column temperature was controlled at 40 ℃; mobile phase A was homogeneously mixed with 0.1% pure formic acid and 5 mmol/L pure ammonium acetate; mobile phase B was homogeneously mixed with pure methanol and ultra-pure water.Linear gradient elution procedures of high performance liquid chromatography were studied.When the detection wavelength was set at 270 nm，more absorption peaks can be detected.In the early stage，the routine reliability methodologies of HPLC were investigated，including specificity，precision，stability，etc.Then the contents of icariin，icariin II，Icariin B，Icariin C were further determined and analyzed.Results：1）Icariin，Icariin II，Chaohoding B and Chaohoding C in Erxian Decoction showed good isolation，and there was no endogenous interfering substance.Each flavonoid had good specificity. 2）The results of linear regression analysis showed that the linear regression equation of icariin was Y=34.012X-12.99; the linear regression equation of icariin II was Y=39.875X-7.134; the linear regression equation of Chaohuoding B was Y=23.997X-8.416; and the linear regression equation of Chaohuoding C was Y=29.896X-15.38. 3）The RSD values of precision tests of icariin，icariin II，Chaixiding B，Chaixiding B，and Chaixiding C were 0.33%，0.64%，0.57%，0.52%.RSD values of stability test were 1.09%，1.62%，1.78%，0.41%.RSD values of repetitive test were 2.61%，2.75%，2.48%，1.22%. 4）The average recoveries of icariin，icariin II，Chaohoding B and Chaohoding C were（96.87±2.15）%，（99.46±1.52）%，（101.64±2.43）%，（99.79±2.31）%，respectively. 5）The content of epimedium flavonoids in Erxian Decoction was higher than that of sample solution of single herb of Herba Epimedii.From the point of view of the content of flavonoids in different habitats of Herba Epimedii，it was found that the content of flavonoids in Herba Epimedii from Sichuan was higher than that in the other 3 habitats，followed by Herba Epimedii from Shaanxi，Herba Epimedii from Hubei，and Herba Epimedii from Hunan.The content of flavonoids was the lowest.Conclusion：The determination of flavonoids in Erxian Decoction by HPLC has good reliability，and the content of flavonoids in Erxian Decoction is higher than that of single herb of Herba Epimedii. Key Words High performance liquid chromatography; Erxian decoction; Icariin; Icariin II; Chaohuding B; Chaohuding C; Content analysis
中图分类号：R289.4;R284 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.006
《中医方剂临床手册》中收录了二仙汤，而这一仅由淫羊藿、仙茅、当归、巴戟天、黄柏、知母组成的药方，是以滋阴温肾与益精降火并重的良方[1]，通过这2个功效对人体进行双重调节，不仅对妇女更年期综合征[2]、性功能减退[3]等有疗效，对骨质疏松症[4-5]，肩周炎[6-7]和老年性失眠[8-9]也有显著的改善作用。二仙汤名字的由来，概其以淫羊藿和仙茅共为君药，而淫羊藿又名仙灵脾，故而命名为二仙汤。仙茅的相关药理研究较多，淫羊藿含有多种黄酮类成分，本研究以二仙汤复方水煎剂和淫羊藿单味药水煎剂，采用高效液相色谱法（HPLC）比较2种不同形式析出的黄酮类成分进行含量测定，比较二仙汤复方水煎剂和淫羊藿单味药水煎剂中黄酮类成分的含量。根据《中华人民共和国药典》淫羊藿中的黄酮类成分较多，本研究主要观察其中最为重要的4中黄酮类成分，分别是淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C[10]。现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器 仪器型号为APS-6080A的高效液相色谱仪购自德国AUPOS科技有限公司（其中恒温箱、自动进样器和荧光检测器的仪器型号分别为：APS-5600、Spark Alias和APS-5600A）;产品型号为CNT SEC-300的色谱柱购自河南奥普斯仪器设备有限公司（孔径：300 ，规格：4.6 mm×150 mm，粒度：5 μm）;产品型号为FA2004B的电子分析天平（读数精度：0.1 mg）购自上海精科天平仪器厂;产品型号为KQ-250DE的台式数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司。
1.2 试药 所有对照品均由上海纯优生物科技有限公司购入，其中淫羊藿苷对照品纯度≥98%（对照药品批号：489-32-7;对照品编号：P0057）、淫羊藿次苷Ⅱ对照品纯度≥95%（对照药品批号：489-32-7;对照品编号：P0057）、朝藿定B对照品纯度≥98%（对照药品批号：110623-73-9;对照品编号：P0355）、朝藿定C对照品纯度≥98%（对照药品批号：110642-44-9;对照品编号：P0356）。HPLC级色谱纯乙腈和HPLC级色谱纯甲醇均购自德国默克（MERCK）公司（药品批号分别为：75-05-8;67-56-1）;HPLC级色谱纯甲酸购自美国飞世尔（FISHER）公司（药品批号：64-18-6）;HPLC级色谱纯甲酸购自美国天地（ACS）公司（药品批号：631-61-8）;本研究中所有的纯净水均由河南中美纯水有限公司提供。
1.3 分析药品 二仙汤：淫羊藿、仙茅、当归、巴戟天均为9 g，黄柏、知母均为6 g。所有药材均由本院药房提供。其中淫羊藿采用4个不同产地的药材，分别为四川、陕西、湖南、湖北。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 进样体积为1 μL;色谱柱的的温度控制在40 ℃;流动相A以0.1%色谱纯甲酸和5 mmol/L的色谱纯乙酸铵均匀混合而成;流动相B以色谱纯甲醇和超纯水均匀混合而成，研究中所有高效液相色谱线性梯度洗脱程序均根据表1进行。检测波长设置在270 nm时可以检测到较多的吸收峰。
2.2 对照品溶液配制 采用精确度为十万分之一的电子分析天平精密分别精密称取淫羊藿苷对照品、淫羊藿次苷Ⅱ对照品、朝藿定B对照品和朝藿定C对照品分别各19.87 mg、19.96 mg、11.65 mg、12.03 mg，分别放置在用标签标记好4个对照品名的10 mL容量瓶中，并用色谱纯甲醇定容至容量瓶刻度，配制成所需质量浓度的单一对照品溶液，最终淫羊藿苷对照品、淫羊藿次苷Ⅱ对照品、朝藿定B对照品和朝藿定C对照品的质量浓度分别为1.987 g/L、1.996 g/L、1.165 g/L、1.203 g/L。将4种对照品溶液混合摇匀后，即得混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液配制
2.3.1 二仙汤供试品溶液配制 根据1.3二仙汤药物组成的配比加入8倍超纯水，煮沸后回流提取浓缩液2 h，分别提取3次后，定容在125 mL的容量瓶中并密闭塞紧瓶盖，后放于超声波中进一步浓缩提取30 min，最后采用孔径只有0.2 μm的有机过滤膜对二仙汤浓缩液进行过滤，所得的续滤液即为二仙汤供试品溶液。
2.3.2 淫羊藿单味药供试品溶液配制 根据1.3二仙汤药物组成中淫羊藿药材的用量，加入8倍超纯水，煮沸后回流提取浓缩液2 h，分别提取3次后，定容在25 mL的容量瓶中并密閉塞紧瓶盖，后放于超声波中进一步浓缩提取30 min，最后采用孔径只有0.2 μm的有机过滤膜对二仙汤浓缩液进行过滤，所得的续滤液即为淫羊藿单味药供试品溶液。
2.3.3 阴性对照溶液配制 根据1.3中除淫羊藿以外的二仙汤药物组成的配比加入8倍超纯水，煮沸后回流提取浓缩液2 h，分别提取3次后，定容在100 mL的容量瓶中并密闭塞紧瓶盖，后放于超声波中进一步浓缩提取30 min，最后采用孔径只有0.2 μm的有机过滤膜不含淫羊藿的二仙汤浓缩液进行过滤，所得的续滤液即为阴性对照供试品溶液。
2.4 专属性试验 采用HPLC对混合对照品溶液、阴性对照供试品溶液、淫羊藿单味药供试品溶液和二仙汤供试品溶液进行专属性试验，本研究结果显示，二仙汤中淫羊藿黄酮类成分淫羊藿苷对照品、淫羊藿次苷Ⅱ对照品、朝藿定B对照品和朝藿定C对照品均可见良好的分离度，最重要的是这4种成分之间并不存在任何内源性的干扰物质，显示各个成分的专属性均较好。见图1。 2.5 线性关系考察 根据对照品溶液配制方法将淫羊藿苷对照品、淫羊藿次苷Ⅱ对照品、朝藿定B对照品和朝藿定C对照品溶液分别根据从低浓度到高浓度的梯度，配制6个浓度梯度的对照品溶液，每个浓度均测试3次，记录色谱峰面积并计算平均值和绘制回归方程，方程中纵坐标Y是各对照品的平均峰面积，横坐标X是各对照品对应的浓度梯度，结果显示淫羊藿苷对照品、淫羊藿次苷Ⅱ对照品、朝藿定B对照品和朝藿定C对照品溶液线性关系考察均显示良好。见表2。
2.6 精密度试验 取同一批次同一时间配制的二仙汤供试品溶液，连续进样6次，检测淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并换算其各自对应的RSD值，结果显示这4个黄酮类成分的RSD值分别为0.33%、0.64%、0.57%、0.52%，符合当RSD值小于3%时，即说明高效液相色谱仪器的精密度良好。见表3。
2.7 稳定性试验 选择同一份二仙汤供试品溶液，根据静置时间的从短到长（0、2、4、8、12、24 h）依次检测二仙汤中黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并换算各成分的RSD值，结果显示这4个黄酮类成分的RSD值分别为1.09%、1.62%、1.78%、0.41%，符合当RSD值小于3%时，即说明二仙汤供试品溶液在静置24 h内都能保持良好的稳定性。见表4。
2.8 重复性试验 取6份同一批次同一制备方法制备的二仙汤供试品溶液，使用同一臺高效液相色谱仪器重复测试该供试品溶液，检测二仙汤中黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的含量并换算各成分的RSD值，结果显示这4个黄酮类成分的RSD值分别为2.61%、2.75%、2.48%、1.22%，符合当RSD值小于3%时，即说明二仙汤供试品溶液能够保持良好的重复性。见表5。
2.9 回收率试验 在含量已知的二仙汤供试品溶液6份中，每一份均加入不同量的对照品溶液，混合均匀后，对混合液和各个对照品溶液分别重复检测6次，检测二仙汤供试品溶液中黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C的平均回收率，结果显示这4个黄酮类成分的平均回收率分别为（96.87±2.15）%、（99.46±1.52）%、（101.64±2.43）%、（99.79±2.31）%，说明采用HPLC法测定二仙汤供试品溶液中黄酮类成分的含量是可靠的。
2.10 样品检测结果 比较二仙汤供试品溶液和淫羊藿单味药材供试品溶液中黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B和朝藿定C这4种黄酮类成分的含量，结果发现二仙汤供试品溶液中淫羊藿黄酮类成分的含量高于淫羊藿单味药材供试品溶液;从淫羊藿不同产地中黄酮类成分含量的角度比较，结果发现四川产地的淫羊藿中测得的黄酮类成分高于其他3个产地，陕西产地淫羊藿次之，其后为湖北淫羊藿产地，而湖南淫羊藿产地黄酮类成分含量最低。见表6。
3 讨论
近年来，二仙汤的相关药理实验研究发现[11-12]，其中淫羊藿含有大量的黄酮类成分，本研究欲通过对淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C等主要黄铜类成分监测并采用HPLC明确各种成分含量，为二仙汤的复方药物质量控制提供更丰富的研究资料。高效液相色谱法作为常用快捷可靠的液相色谱技术，为复杂体系中药复方的药物成分分离分析提供了良好的平台。HPLC的稳定性十分良好[13-15]，本研究结果也证实了这一点，因此本研究采用HPLC测定二仙汤中4种淫羊藿黄酮类成分能够把每次测量的误差降到最低，进一步保障检测结果的准确性，为二仙汤的复方药物质量控制和相关新制剂研究提供高可信度的参考依据。本研究通过比较二仙汤水煎剂和淫羊藿单味药材水煎剂中淫羊藿黄酮类成分含量，结果表明二仙汤中淫羊藿黄酮类成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C的含量均较淫羊藿单位要从水煎剂高，这4种黄酮类成分的含量以朝藿定C最高，淫羊藿苷次之，接着是淫羊藿次苷Ⅱ，而朝藿定B含量最少。本研究结果阐释在临床上二仙汤水煎剂有效保证了复方中黄酮类成分的含量，能够最大化实现临床疗效。另外，本研究有进一步选择淫羊藿常见的4个不同产地的药材，经过对比，结果发现四川产地的淫羊藿中测得的黄酮类成分高于其他3个产地，陕西产地淫羊藿次之，其后为湖北淫羊藿产地，而湖南淫羊藿产地黄酮类成分含量最低。这4个产地中四川淫羊藿的黄酮类成分含量最高，可能与该产地的地理位置和气候等因素有关。
综上所述，本研究建立的HPLC同时测定二仙汤中淫羊藿黄酮类成分中的4种主要成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ、朝藿定B、朝藿定C的含量，这一检测方法不仅操作过程简单便捷，而且方法上具有良好的精密度、稳定性和重复性[16-17]，能够指导临床上二仙汤的复方药物质量控制和新药研发提供研究基础。
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（2019-03-13收稿 责任编辑：杨觉雄）