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【摘 要】目的： 通过检测结核病患者痰液中的耐药基因，确定对结核杆菌耐药性。方法：选取2018年6月～2019年6月在本院就诊的已使用乙胺丁醇（EMB）超过6个月以上的结核病患者80例作为本次研究对象。对比传统检测法与分子生物学检测法检测结核杆菌的耐药性。结论：传统方法检测结核杆菌阳性率低于分子生物PCR检测方法，两种检测方法存在差异具有统计学意义（P<0.05）。讨论：分子生物PCR检测结核杆菌耐药基因的存在方法简便快捷，并且灵敏度高于传统检测方法，具有较高的诊断价值，适合在临床推广并应用。
【关键词】结核杆菌;痰液;传统检测法;PCR
【中图分类号】R521.05 【文献标识码】A 【文章编号】1002-8714（2019）10-0083-02
据统计，目前全球共有1040万结核病患者，其中2017年全球新增多药耐药结核患者49万人，其中有6.3%的患者存在广泛耐药性。我国是结核病的高负担国家之一，并存在严重耐药问题。2017年我国新增结核患者达90万，其中耐药比例达8.0%，显著高于世界平均水平。传统的结核杆菌检测方法是通过取患者痰液，通过涂片及痰液培养来确定是否感染结核杆菌。但由于实验周期长，并且不能检测出结核杆菌分支杆菌是否具有耐药性，不能够满足临床需求。因此需要一种新的方法进行检测。乙胺丁醇（EMB）是广谱抗分枝杆菌活性的一线抗结核药物。结核分枝杆菌耐药性机制可能与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embB基因（尤其是306位密码子）突变有关[3]。本文利用分子生物检测方法，即PCR检测法分别从肺结核患者痰基因，并将耐菌株检测出来，结果如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料 选取2018年6月～2019年6月在本院就诊的已使用乙胺丁醇（EMB）超过6个月以上的结核病患者80例作为本次研究对象，其中男性患者46例，女性患者34例，年龄29～76岁，平均年龄（43.4±2.6）岁，所有入组患者均对本研究有充分了解，并签署知情同意。
1.2方法仪器 收集80例患者的痰液标本，分别进行痰液培养与PCR检测。痰液培养按《结核病诊断实验室检验规程》[4]进行痰抗酸杆菌分离培养、分枝杆菌菌群鉴定。生物检测技术则使用仪器是，GeneAmp 9700型PCR仪。标本处理：吸取患者痰液，加入浓度为4%NaOH溶液，然后摇匀，在室温下静止放置30min，待其液化，取1ml放入离心管中，在离心机中进行离心转数12000rpm，时间5min，静止分层，去除上清液，留沉淀后，加入1ml无菌生理盐水，用移液枪吹匀，再次放入离心机中进行离心，转数12000rpm，時间5min，重复洗涤2次[3]。吸取上清液后加入50μDNA提取液，充分混合均匀后。检测方法：所有标本均使用浓缩集菌涂片抗酸染色显微镜检查及荧光定量PCR检测。PCR检测方法：设计引物序列，引物序列参照文献[3]。上游引物：5′-TTAGATACTTCACCCTGACCGACGC-3′;下游引物：5′-CAACTTACGGTGAA CAGGCATAGCG-3′。取PCR反应管，将处理后的保本加入其内部，8000rpm离心5s，将反应管放入PCR检测仪中，进行DNA扩增，反应条件93℃，2min预变性;再93℃，45s，55℃，120s，进行30个循环后放入33℃环境中保温，PCR反应后进行荧光监测，在PCR试管充分的冷却到33℃，迅速将扩增后的反应管放入荧光检测仪中，读取并记录，荧光激发波长是487mm，检测波长是525mm。切取凝胶电泳胶带，进行DNA序列分析。
1.3统计学方法 本研究数据均用SPSS20.0统计软件处理，计数用例数（n）表示，计数组间率（%）表示。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
传统方法通过痰涂片法检查诊断产生耐药阳性8例，阳性率10%，分子生物检测方法的荧光定量PCR阳性例数为12例，阳性率18.75%。传统方法检测结核杆菌阳性率低于分子生物PCR检测方法，两种检测方法存在差异具有统计学意义（P<0.05），如表1所示。PCR法出结果时间很快，即当天既能出结果，传统法则需要培养痰液数周才能出结果。
3 讨论
结核是一种全球性疾病，其发病率呈显著上升趋势。结核患病早期往往没有明显症状，结核病的诊断成为了临床研究的重点。传统涂片法很方便地检测出结核分枝杆菌，而且费用低廉，符合我国国情，但阳性检测率低，不能及时地判断患者是否感染结核杆菌，也不能及时判断出结核杆菌是否具有耐药性，可能会造成病情的延误。但当前痰培养仍是临床检验结核病的金标准，对药敏实验结果有中药的意义。不过时间较长，需要对方法进行改进。
分子生物检测方法PCR技术通过基因扩增，检测结核杆菌基因的存在，同时减少了假阳性结果的出现，灵敏度和特异性均较高。
综上所述，在结核杆菌的检测中，分子生物PCR检测结核杆菌耐药基因的存在方法简便快捷，并且灵敏度高于传统检测方法，具有较高的诊断价值，适合在临床推广并应用。
参考文献
[1] 冯阳. 重症医学科呼吸机相关性肺炎的危险因素及病原学特点分析[D].贵州医科大学，2018.
[2] 杨松，张耀亭.痰耐药结核分枝杆菌embB基因的快速检测及乙胺丁醇耐药机制研究[J].
临床肺科杂志，2009，14（02）：145-147.
[3] 张俊仙，吴雪琼，韩慧新等. 结核病临床分离株及痰标本中embB基因型的快速测定.中国抗生素杂志，2005，30（2）：100-102
[4] 中国防痨协会基础专业委员会编著.结核病诊断实验室检验规程，北京：中国教育文化出版社，2006，30-37.
【关键词】结核杆菌;痰液;传统检测法;PCR
【中图分类号】R521.05 【文献标识码】A 【文章编号】1002-8714（2019）10-0083-02
据统计，目前全球共有1040万结核病患者，其中2017年全球新增多药耐药结核患者49万人，其中有6.3%的患者存在广泛耐药性。我国是结核病的高负担国家之一，并存在严重耐药问题。2017年我国新增结核患者达90万，其中耐药比例达8.0%，显著高于世界平均水平。传统的结核杆菌检测方法是通过取患者痰液，通过涂片及痰液培养来确定是否感染结核杆菌。但由于实验周期长，并且不能检测出结核杆菌分支杆菌是否具有耐药性，不能够满足临床需求。因此需要一种新的方法进行检测。乙胺丁醇（EMB）是广谱抗分枝杆菌活性的一线抗结核药物。结核分枝杆菌耐药性机制可能与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embB基因（尤其是306位密码子）突变有关[3]。本文利用分子生物检测方法，即PCR检测法分别从肺结核患者痰基因，并将耐菌株检测出来，结果如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料 选取2018年6月～2019年6月在本院就诊的已使用乙胺丁醇（EMB）超过6个月以上的结核病患者80例作为本次研究对象，其中男性患者46例，女性患者34例，年龄29～76岁，平均年龄（43.4±2.6）岁，所有入组患者均对本研究有充分了解，并签署知情同意。
1.2方法仪器 收集80例患者的痰液标本，分别进行痰液培养与PCR检测。痰液培养按《结核病诊断实验室检验规程》[4]进行痰抗酸杆菌分离培养、分枝杆菌菌群鉴定。生物检测技术则使用仪器是，GeneAmp 9700型PCR仪。标本处理：吸取患者痰液，加入浓度为4%NaOH溶液，然后摇匀，在室温下静止放置30min，待其液化，取1ml放入离心管中，在离心机中进行离心转数12000rpm，时间5min，静止分层，去除上清液，留沉淀后，加入1ml无菌生理盐水，用移液枪吹匀，再次放入离心机中进行离心，转数12000rpm，時间5min，重复洗涤2次[3]。吸取上清液后加入50μDNA提取液，充分混合均匀后。检测方法：所有标本均使用浓缩集菌涂片抗酸染色显微镜检查及荧光定量PCR检测。PCR检测方法：设计引物序列，引物序列参照文献[3]。上游引物：5′-TTAGATACTTCACCCTGACCGACGC-3′;下游引物：5′-CAACTTACGGTGAA CAGGCATAGCG-3′。取PCR反应管，将处理后的保本加入其内部，8000rpm离心5s，将反应管放入PCR检测仪中，进行DNA扩增，反应条件93℃，2min预变性;再93℃，45s，55℃，120s，进行30个循环后放入33℃环境中保温，PCR反应后进行荧光监测，在PCR试管充分的冷却到33℃，迅速将扩增后的反应管放入荧光检测仪中，读取并记录，荧光激发波长是487mm，检测波长是525mm。切取凝胶电泳胶带，进行DNA序列分析。
1.3统计学方法 本研究数据均用SPSS20.0统计软件处理，计数用例数（n）表示，计数组间率（%）表示。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
传统方法通过痰涂片法检查诊断产生耐药阳性8例，阳性率10%，分子生物检测方法的荧光定量PCR阳性例数为12例，阳性率18.75%。传统方法检测结核杆菌阳性率低于分子生物PCR检测方法，两种检测方法存在差异具有统计学意义（P<0.05），如表1所示。PCR法出结果时间很快，即当天既能出结果，传统法则需要培养痰液数周才能出结果。
3 讨论
结核是一种全球性疾病，其发病率呈显著上升趋势。结核患病早期往往没有明显症状，结核病的诊断成为了临床研究的重点。传统涂片法很方便地检测出结核分枝杆菌，而且费用低廉，符合我国国情，但阳性检测率低，不能及时地判断患者是否感染结核杆菌，也不能及时判断出结核杆菌是否具有耐药性，可能会造成病情的延误。但当前痰培养仍是临床检验结核病的金标准，对药敏实验结果有中药的意义。不过时间较长，需要对方法进行改进。
分子生物检测方法PCR技术通过基因扩增，检测结核杆菌基因的存在，同时减少了假阳性结果的出现，灵敏度和特异性均较高。
综上所述，在结核杆菌的检测中，分子生物PCR检测结核杆菌耐药基因的存在方法简便快捷，并且灵敏度高于传统检测方法，具有较高的诊断价值，适合在临床推广并应用。
参考文献
[1] 冯阳. 重症医学科呼吸机相关性肺炎的危险因素及病原学特点分析[D].贵州医科大学，2018.
[2] 杨松，张耀亭.痰耐药结核分枝杆菌embB基因的快速检测及乙胺丁醇耐药机制研究[J].
临床肺科杂志，2009，14（02）：145-147.
[3] 张俊仙，吴雪琼，韩慧新等. 结核病临床分离株及痰标本中embB基因型的快速测定.中国抗生素杂志，2005，30（2）：100-102
[4] 中国防痨协会基础专业委员会编著.结核病诊断实验室检验规程，北京：中国教育文化出版社，2006，30-37.