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[摘要]目的研究siRNA沉默FOXF2基因对宫颈癌Hela细胞迁移与增殖的影响。方法采用Real Time-PCR、WesternBlot法检测siRNA沉默FOXF2后，Hela细胞中FOXF2基因mRNA、蛋白表达的变化；用划痕试验检测siRNA沉默FOXF2后细胞的迁移能力，CCK8检测siRNA沉默FOXF2后细胞的增殖能力。结果Hela细胞内FOXF2基因沉默后，Real Time-PCR、Western Blot检测显示siRNA沉默FOXF2组FOXF2基因mRNA、蛋白的表达均明显下降（P<0.01）；划痕试验显示细胞迁移能力增强（P<0.01）；CCK8检测显示siRNA沉默FOXF2组细胞增殖能力增强（P<0.01）。结论SiRNA沉默FOXF2基因促进Hela细胞的迁移与增殖能力。
[关键词]宫颈癌；FOXF2；细胞迁移；细胞增殖
[中图分类号]R737.33
[文献标识码]A
[文章编号]2095-0616（2017）03-30-04
宫颈癌是妇科最常见的生殖道恶性肿瘤之一，在全球其发病率仅次于乳腺癌。死亡率在妇科生殖道恶性肿瘤中占首位，其主要原因是肿瘤的侵袭及转移。当前宫颈癌的治疗方案主要是手术治疗、放疗、化疗、生物治疗及综合治疗等，多半在破坏肿瘤的同时，其对正常的细胞组织也产生了或多或少的损伤。该疾病的发病原因涉及致癌基因的激活和或抑癌基因的失活以及表观遗传学的改变等，是多阶段、多因子的复杂调控过程。现宫颈癌明确的病因和发病机制尚不明确，其靶向治疗是科学界较热门的研究内容。又头框转录因子F2（forkheadboxF2，FOXF2）蛋白是FOX家族的重要成员，它的特点是高度保守的DNA结合结构域和组织特异性表达模式，它在细胞的生长和分化、调节胚胎的生成，和组织发展起着重要的作用。最近的研究表明，FOX基因的失调与肿瘤发生和肿瘤进展相关。有研究表明，FOXF2的低表达与乳腺癌患者的早发性转移和预后不良相关。目前仍无FOXF2基因与宫颈癌的相关性报道。本研究从分子水平来阐述宫颈癌的发病机制，为宫颈癌分子靶标治疗的筛选提供有力依据。
1.材料与方法
1.1材料
人宫颈癌Hela细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，natocor），DMEM购自美国Gibco OptiMEM@I Medium和转染试剂脂质体Lipofectaminetm 3000購自美国Invitrogen公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Coming公司。RT-PCR试剂购自日本Takara。FOXF2 siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，包含3条目的siRNA链，1条阴性对照siRNA链。Si-FOXF2 1305序列为：5’GCAUCACUCUACU CCAGUGTT-3’；Si-FOXF2 1415序列为：5’-GCGUCUGUCAGGAUAUUAATT-3’；Si-FOXF2 650序列为：5’CCAGCGAGUUCAUG UUCGATT-3’；阴性对照组（si-negative control）siRNA序列为：5’-UUCUUCG AACGUGUCAC GUTT-3’。兔抗人FOXF2 Ab、兔抗人GAPDH Ab购自美国Abcam公司。Hela细胞分为5组：Hela SNC组、Si-FOXF21305组、Si-FOXF2 1415组、Si-FOXF2 650组及未经任何处理的Hela细胞作为对照组。
1.2方法
1.2.1细胞培养Hela细胞复苏，加入含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素及10%FBS的DEME中培养，置入37℃、5%CO2培养箱内，24h内更换培养液。对数生长期时，用0.25%胰酶消化、传代、冻存。
1.2.2细胞转染转染前一天将Hela细胞接种于6孔板中，转染时细胞融合达到30%一40%，PBS洗涤3遍，每孔加入900uLOptiMEM@IMedium。将3uL的Lip03000和5uL的siRNA分别与50uL的optiMEM@I Medium混悬，轻轻混匀后静置5min。将含有Lip03000和siRNA的OptiMEM@I Medium轻轻混匀后静置20min。将混匀的100uLDNA脂质体复合物均匀滴入含有optiMEM@I Medium的细胞中。48h后提取RNA。
1.2.3 Rea]Tme-PCR检测各组FOXF2 mRNA的表达终点提取RNA，采用紫外/可见光分光光度仪测量细胞样品总RNA的浓度和纯度，（A260/A280）为1.9～2.1之间提示RNA质量良好。随按Takara反转录试剂盒步骤将RNA逆转录为cDNA。设计引物序列为：GAPDH上游：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游：5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’；FOXF2上游：5’TCGCTGGAGCAGAGC TACTT-3’，下游：5’CCCATTGAAGTI"GAGGACGA-3’。最终获得转染率最高的si-Foxf2序列。
1.2.4蛋白印迹法检测的3组FOXF2蛋白的表达按上述方法转染细胞，分为Hela SNC组、Si-FOXF2 1415组和未经任何处理的SiHa细胞作为对照组。72h后加入适量的RIPA裂解液裂解细胞（凯基，南京1可获得总蛋白。根据BCA试剂盒（康为，北京）测蛋白浓度。GAPDH为内参，按10%分离胶、6%浓缩胶制胶，按浓缩胶80V、分离胶120V恒压电泳，200mA转膜，5%BSA封闭1～2h，1×TBST洗涤后孵一抗（兔抗人FOXF2 1：1000，兔抗人GAPDH 1：10000）4°过夜，次日1×TBST洗涤后孵二抗（羊抗兔1：2000）1h，洗涤，ECL显影（merckmillipore）。实验重复3次。 1.2.5细胞划痕实验待转染后取细胞融合90%时，用200uL移液枪头沿培养板底部呈一字型划痕，用PBS洗涤3遍，换上DMEM培养液，分别于培养0、12、24、36、48、60、72h在倒置显微镜下（10×10）测量划痕的宽度。细胞迁移率=（1-即时划痕宽度/原始劃痕宽度）×100%。
1.2.6 CCK8检测细胞增殖实验0.25%胰酶消化转染24h后Hela SNC组、Si-FOXF2 1415组和未处理Hela组的细胞，用10%FBS的培养基重悬细胞，在96孔板中加入100uL（9×103）的细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24h。PBS洗涤3遍，将每孔加入90uL DMEM及10uL CCK8的混合液，避光，将培养板在培养箱内孵育1～4h。酶标仪测定450nm处的吸光值。计算细胞活性公式：细胞增值率（%）=（处理组OD450-空白孔OD450）/（空白对照组OD450-空白孔OD450）]×100%。
1.3统计学处理
采用GraphPad Prism软件进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间两两比较采用t检验及单因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 siRNA沉默FOXF2基因对Hela细胞FOXF2mRNA表达的影响
统计结果显示方差不齐（F=3.82，P=0.039），使用Dunnett T3进行各组见多重比较。结果显示：3条siRNA链沉默FOXF2后，siRNA-FOXF2mRNA较Hela细胞SNC组及Hela细胞组明显下降（65%～85%），差异有统计学意义（P<0.001），其中siRNA-FOXF2 1415链下降最明显，选取其后续实验。见图1，表1。
2.2 siRNA沉默FoxF2基因对Hela细胞FOXF2蛋白表达的影响
Western blot结果显示：siRNA沉默FOXF2基因后，Hela细胞FOXF2蛋白表达水平较Hela细胞SNC组及Hela细胞组明显降低，进一步证实转染有效。见图2。
2.3siR NA沉默FOXF2基因对Hela细胞迁移力的影响
细胞划痕试验显示，siRNA沉默FOXF2基因后，Hela细胞的迁移能力明显高于Hela细胞SNC组及Hela细胞组。见图3。
2.4 CCK8检测siR.NA～FOXF2基因对Hdafi～胞增殖的影响
CCK8实验结果显示：siRNA-FOXF2 1415组细胞增殖率明显高于Hela细胞SNC组及Hela细胞组。统计结果显示方差齐（f=3.155，P=0.116）。见表2，图4。
3.讨论
宫颈癌跟大多数肿瘤相似，是以细胞过度增殖、无限生长为特征的疾病，体现在肿瘤细胞过度增殖，肿瘤组织的快速生长，进而加剧恶性程度，该过程中主要的因素是癌基因的激活和或抑癌基因的失活。当前宫颈癌的治疗方案主要是手术治疗、放疗、化疗、生物治疗及综合治疗等，多半在破坏肿瘤的同时，其对正常的细胞组织也产生了或多或少的损伤。且宫颈癌细胞对放化疗出现越来越多的耐受现象，迫切需要对肿瘤细胞特异性的靶点治疗。RNA干扰是由双链RNA（dsRNA）诱发、进化过程高度保守、高效特异性的降解同源mRNA现象。将特异性siRNA转染入生物细胞内即可引发RNA干扰，进而对特定基因的表达起到抑制作用。大量文献表明，RNA干扰可用于治疗单基因疾病和蛋白过度表达相关疾病。肿瘤的发生是细胞增殖、凋亡失衡的结果，特异性靶向基因治疗是提高治疗效果的一个有效途径。随着siRNA技术的不断进步，多靶点的联合治疗在促肿瘤细胞凋亡及提高其对化疗药物的敏感性中发挥重要作用，具有良好的应用前景。
又头框转录因子F2（forkhead boxF2，FOXF2）蛋白是FOX家族的重要成员，是间质转录因子，在与上皮相邻的间质中特异性表达，调控上皮间质之间的相互转化维持组织稳态。研究表明FOXF2在前列腺良性增生及正常前列腺组织中高表达，而在前列腺癌中较少表达。也有研究表明，FOXF2的低表达与乳腺癌的早期转移有关，且提示预后不良。在癌细胞的调查研究表明FOXF2的低表达与细胞过度增殖相关，这与本研究结果一致。SiRNA沉默FOXF2后，FOXF2的低表达促进细胞的迁移及增殖，促进肿瘤的发展，进而加重肿瘤的恶性程度。阐明了FOXF2与宫颈癌发生发展的分子机制，为宫颈癌的靶向治疗提供理论依据。
[关键词]宫颈癌；FOXF2；细胞迁移；细胞增殖
[中图分类号]R737.33
[文献标识码]A
[文章编号]2095-0616（2017）03-30-04
宫颈癌是妇科最常见的生殖道恶性肿瘤之一，在全球其发病率仅次于乳腺癌。死亡率在妇科生殖道恶性肿瘤中占首位，其主要原因是肿瘤的侵袭及转移。当前宫颈癌的治疗方案主要是手术治疗、放疗、化疗、生物治疗及综合治疗等，多半在破坏肿瘤的同时，其对正常的细胞组织也产生了或多或少的损伤。该疾病的发病原因涉及致癌基因的激活和或抑癌基因的失活以及表观遗传学的改变等，是多阶段、多因子的复杂调控过程。现宫颈癌明确的病因和发病机制尚不明确，其靶向治疗是科学界较热门的研究内容。又头框转录因子F2（forkheadboxF2，FOXF2）蛋白是FOX家族的重要成员，它的特点是高度保守的DNA结合结构域和组织特异性表达模式，它在细胞的生长和分化、调节胚胎的生成，和组织发展起着重要的作用。最近的研究表明，FOX基因的失调与肿瘤发生和肿瘤进展相关。有研究表明，FOXF2的低表达与乳腺癌患者的早发性转移和预后不良相关。目前仍无FOXF2基因与宫颈癌的相关性报道。本研究从分子水平来阐述宫颈癌的发病机制，为宫颈癌分子靶标治疗的筛选提供有力依据。
1.材料与方法
1.1材料
人宫颈癌Hela细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，natocor），DMEM购自美国Gibco OptiMEM@I Medium和转染试剂脂质体Lipofectaminetm 3000購自美国Invitrogen公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Coming公司。RT-PCR试剂购自日本Takara。FOXF2 siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成，包含3条目的siRNA链，1条阴性对照siRNA链。Si-FOXF2 1305序列为：5’GCAUCACUCUACU CCAGUGTT-3’；Si-FOXF2 1415序列为：5’-GCGUCUGUCAGGAUAUUAATT-3’；Si-FOXF2 650序列为：5’CCAGCGAGUUCAUG UUCGATT-3’；阴性对照组（si-negative control）siRNA序列为：5’-UUCUUCG AACGUGUCAC GUTT-3’。兔抗人FOXF2 Ab、兔抗人GAPDH Ab购自美国Abcam公司。Hela细胞分为5组：Hela SNC组、Si-FOXF21305组、Si-FOXF2 1415组、Si-FOXF2 650组及未经任何处理的Hela细胞作为对照组。
1.2方法
1.2.1细胞培养Hela细胞复苏，加入含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素及10%FBS的DEME中培养，置入37℃、5%CO2培养箱内，24h内更换培养液。对数生长期时，用0.25%胰酶消化、传代、冻存。
1.2.2细胞转染转染前一天将Hela细胞接种于6孔板中，转染时细胞融合达到30%一40%，PBS洗涤3遍，每孔加入900uLOptiMEM@IMedium。将3uL的Lip03000和5uL的siRNA分别与50uL的optiMEM@I Medium混悬，轻轻混匀后静置5min。将含有Lip03000和siRNA的OptiMEM@I Medium轻轻混匀后静置20min。将混匀的100uLDNA脂质体复合物均匀滴入含有optiMEM@I Medium的细胞中。48h后提取RNA。
1.2.3 Rea]Tme-PCR检测各组FOXF2 mRNA的表达终点提取RNA，采用紫外/可见光分光光度仪测量细胞样品总RNA的浓度和纯度，（A260/A280）为1.9～2.1之间提示RNA质量良好。随按Takara反转录试剂盒步骤将RNA逆转录为cDNA。设计引物序列为：GAPDH上游：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游：5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’；FOXF2上游：5’TCGCTGGAGCAGAGC TACTT-3’，下游：5’CCCATTGAAGTI"GAGGACGA-3’。最终获得转染率最高的si-Foxf2序列。
1.2.4蛋白印迹法检测的3组FOXF2蛋白的表达按上述方法转染细胞，分为Hela SNC组、Si-FOXF2 1415组和未经任何处理的SiHa细胞作为对照组。72h后加入适量的RIPA裂解液裂解细胞（凯基，南京1可获得总蛋白。根据BCA试剂盒（康为，北京）测蛋白浓度。GAPDH为内参，按10%分离胶、6%浓缩胶制胶，按浓缩胶80V、分离胶120V恒压电泳，200mA转膜，5%BSA封闭1～2h，1×TBST洗涤后孵一抗（兔抗人FOXF2 1：1000，兔抗人GAPDH 1：10000）4°过夜，次日1×TBST洗涤后孵二抗（羊抗兔1：2000）1h，洗涤，ECL显影（merckmillipore）。实验重复3次。 1.2.5细胞划痕实验待转染后取细胞融合90%时，用200uL移液枪头沿培养板底部呈一字型划痕，用PBS洗涤3遍，换上DMEM培养液，分别于培养0、12、24、36、48、60、72h在倒置显微镜下（10×10）测量划痕的宽度。细胞迁移率=（1-即时划痕宽度/原始劃痕宽度）×100%。
1.2.6 CCK8检测细胞增殖实验0.25%胰酶消化转染24h后Hela SNC组、Si-FOXF2 1415组和未处理Hela组的细胞，用10%FBS的培养基重悬细胞，在96孔板中加入100uL（9×103）的细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24h。PBS洗涤3遍，将每孔加入90uL DMEM及10uL CCK8的混合液，避光，将培养板在培养箱内孵育1～4h。酶标仪测定450nm处的吸光值。计算细胞活性公式：细胞增值率（%）=（处理组OD450-空白孔OD450）/（空白对照组OD450-空白孔OD450）]×100%。
1.3统计学处理
采用GraphPad Prism软件进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间两两比较采用t检验及单因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 siRNA沉默FOXF2基因对Hela细胞FOXF2mRNA表达的影响
统计结果显示方差不齐（F=3.82，P=0.039），使用Dunnett T3进行各组见多重比较。结果显示：3条siRNA链沉默FOXF2后，siRNA-FOXF2mRNA较Hela细胞SNC组及Hela细胞组明显下降（65%～85%），差异有统计学意义（P<0.001），其中siRNA-FOXF2 1415链下降最明显，选取其后续实验。见图1，表1。
2.2 siRNA沉默FoxF2基因对Hela细胞FOXF2蛋白表达的影响
Western blot结果显示：siRNA沉默FOXF2基因后，Hela细胞FOXF2蛋白表达水平较Hela细胞SNC组及Hela细胞组明显降低，进一步证实转染有效。见图2。
2.3siR NA沉默FOXF2基因对Hela细胞迁移力的影响
细胞划痕试验显示，siRNA沉默FOXF2基因后，Hela细胞的迁移能力明显高于Hela细胞SNC组及Hela细胞组。见图3。
2.4 CCK8检测siR.NA～FOXF2基因对Hdafi～胞增殖的影响
CCK8实验结果显示：siRNA-FOXF2 1415组细胞增殖率明显高于Hela细胞SNC组及Hela细胞组。统计结果显示方差齐（f=3.155，P=0.116）。见表2，图4。
3.讨论
宫颈癌跟大多数肿瘤相似，是以细胞过度增殖、无限生长为特征的疾病，体现在肿瘤细胞过度增殖，肿瘤组织的快速生长，进而加剧恶性程度，该过程中主要的因素是癌基因的激活和或抑癌基因的失活。当前宫颈癌的治疗方案主要是手术治疗、放疗、化疗、生物治疗及综合治疗等，多半在破坏肿瘤的同时，其对正常的细胞组织也产生了或多或少的损伤。且宫颈癌细胞对放化疗出现越来越多的耐受现象，迫切需要对肿瘤细胞特异性的靶点治疗。RNA干扰是由双链RNA（dsRNA）诱发、进化过程高度保守、高效特异性的降解同源mRNA现象。将特异性siRNA转染入生物细胞内即可引发RNA干扰，进而对特定基因的表达起到抑制作用。大量文献表明，RNA干扰可用于治疗单基因疾病和蛋白过度表达相关疾病。肿瘤的发生是细胞增殖、凋亡失衡的结果，特异性靶向基因治疗是提高治疗效果的一个有效途径。随着siRNA技术的不断进步，多靶点的联合治疗在促肿瘤细胞凋亡及提高其对化疗药物的敏感性中发挥重要作用，具有良好的应用前景。
又头框转录因子F2（forkhead boxF2，FOXF2）蛋白是FOX家族的重要成员，是间质转录因子，在与上皮相邻的间质中特异性表达，调控上皮间质之间的相互转化维持组织稳态。研究表明FOXF2在前列腺良性增生及正常前列腺组织中高表达，而在前列腺癌中较少表达。也有研究表明，FOXF2的低表达与乳腺癌的早期转移有关，且提示预后不良。在癌细胞的调查研究表明FOXF2的低表达与细胞过度增殖相关，这与本研究结果一致。SiRNA沉默FOXF2后，FOXF2的低表达促进细胞的迁移及增殖，促进肿瘤的发展，进而加重肿瘤的恶性程度。阐明了FOXF2与宫颈癌发生发展的分子机制，为宫颈癌的靶向治疗提供理论依据。