[摘要] 目的 通过miRNA介导RNAi沉默OPN表达探讨其对人肺腺癌细胞株A549顺铂(DDP)敏感性的影响。方法 利用体外构建的靶向OPN的miRNA表达质粒瞬时转染A549,酶联免疫吸咐法(ELISA)检测转染后48h细胞OPN蛋白表达;转染后24、48、72、96h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分别检测转染细胞和转染联合5μg/mL顺铂作用后细胞的增殖;于转染后24h联合不同浓度的顺铂作用48h,MTT法检测细胞增殖抑制率。结果 (1)转染后48h,OPN蛋白表达水平下调了47.34%(P全文查看链接 　　1 材料与方法 全文查看链接 　　RNAi广泛用于抑制基因表达和研究基因功能。它是指细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(dsRNA)时,mRNA发生降解而导致基因表达沉默。这种现象发生在转录后水平,又称为转录后基因沉默(PTGS)。RNAi可由miRNA和siRNA两种形式的小RNA介导。siRNA在肿瘤基因治疗方面取得了重大进展。研究表明靶向OPN的siRNA能有效沉默基因表达,使细胞生长速度减慢,侵袭和转移能力减弱,并抑制裸鼠体内肿瘤生长[10-14]。最近越来越多的研究人员通过模拟体内天然miRNA的成熟过程,利用带有polⅡ启动子的表达载体表达具有miRNA前体结构的shRNA来进行RNAi的研究,且具有更强的RNA干扰效应[15]。由慢病毒介导的miRNA干扰抑制肝癌细胞OPN蛋白表达从而使细胞生长速度明显减慢,细胞侵袭能力减弱[16]。本研究使用的干扰质粒由 Invitrogen公司构建,可在动物细胞内表达靶向调控OPN基因的miRNA。该质粒以鼠miR-154序列为骨架,且带有巨细胞病毒启动子,并优化茎环结构确保目的基因的高效敲除率。该质粒带有加强型绿色荧光蛋白(EmGFP)基因,可很方便地示踪miRNA的表达情况,并提供了EmGFP表达与miRNA基因敲除效率的强对比。本实验结果显示转染48h后,OPN蛋白水平下降了47.34 %。在转染48、72、96h后,转染组细胞生长曲线明显下移,细胞生长速度减慢。说明抑制OPN表达后,A549细胞的恶性增殖得到一定控制,为肺癌的基因治疗提供实验基础。 全文查看链接 　　[13] Wu Y,DT Denhardt,SR Rittling. Osteopontin is required for full expression of the transformed phenotype by the ras oncogene[J]. Br J Can- cer,2000,83(2):156-163. 全文查看链接