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【摘要】目的观察溶血磷脂酸对宫颈癌细胞株Siha生长及细胞形态的影响。方法①体外培养人宫颈癌细胞株Siha，以终浓度为1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L的溶血磷脂酸和终浓度为5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L的多西环素分别干预，并设不加任何药物作为空白对照组。各组均干预72 h后进行过碘酸雪夫反应 （PAS）染色，用倒置显微镜观察各组宫颈癌细胞的生长及形态变化。②体外培养Siha细胞，用终浓度为10 μmol/L的溶血磷脂酸和终浓度为40 mg/L的多西环素干预，72 h后固定过夜，电镜扫描。结果①溶血磷脂酸组Siha细胞随着溶血磷脂酸浓度升高，癌细胞数量明显增多，细胞异形性及可塑性增加；多西环素处理组随着多西环素浓度增加，细胞数量明显减少，细胞核固缩、碎裂，细胞破坏。②电镜下可见经溶血磷脂酸干预后Siha细胞表面出现大量分泌颗粒，细胞变形伸出细长突起相互连接。多西环素组干预者则细胞数量减少，形态轮廓不清晰，细胞皱缩变形，核碎裂，细胞溶解。结论溶血磷脂酸促进宫颈癌细胞株Siha生长增殖并改变Siha细胞形态，而多西环素则具有相反的抑制作用。
【关键词】溶血磷脂酸；宫颈癌；细胞形态
文章编号：1003-1383（2013）03-0323-03中图分类号：R737.33文献标识码：A
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在发展中国家其发病率位居女性恶性肿瘤之首。长期以来宫颈癌主要的治疗手段包括手术治疗和放疗，但由于受到远处转移和局部复发的制约，其治疗效果并不理想，总的5年生存率仍徘徊在40%左右[1]。因此寻找新的更有效的化疗药物，解决宫颈癌的浸润、转移问题成为目前研究的热点。本研究通过体外试验，观察激动剂溶血磷脂酸和抑制剂多西环素对宫颈癌细胞株Siha生长增殖的影响，为进一步研究宫颈癌浸润、转移和寻找药物作用的新靶点提供试验基础和理论依据。材料与方法1.材料人宫颈癌细胞株Siha购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，溶血磷脂酸购自Cayman公司，多西环素购自生工生物工程（上海）有限公司。
2.方法
（1）细胞培养：宫颈癌细胞株Siha常规培养于含有10%小牛血清、50 IU/ml青霉素和50 mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，在37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养。取生长状态良好的Siha细胞，以每孔1×104的密度进行细胞爬片，24 h后弃去培养液。然后溶血磷脂酸组各孔分别加入溶血磷脂酸终浓度为1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L的培养液，多西环素组各孔加入多西环素终浓度分别为5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L的培养液，空白组用RPMI 1640细胞培养液处理。各组继续培养72小时进行过碘酸雪夫氏（PAS）染色，在倒置显微镜下观察细胞形态。
（2）扫描电镜：取生长状态良好的Siha细胞，以1×106密度进行细胞爬片，12 h后细胞贴壁，溶血磷脂酸组加入溶血磷脂酸终浓度为10 μmol/L的培养液、多西环素组加入多西环素终浓度为40 mg/L的培养液、空白组用RPMI 1640细胞培养液处理，72 h后用固定液4℃避光固定过夜，电镜扫描。结果 1.宫颈癌Siha细胞体外培养形态观察在倒置显微镜下观察，可见空白组细胞平铺贴壁生长，呈梭形，细胞饱满，轮廓清晰，细胞之间排列密集，细胞间无接触抑制，多见分裂相细胞。经溶血磷脂酸干预后细胞数量明显增多，胞浆丰富，癌细胞变为多边形，彼此之间呈镶嵌样生长，部分细胞呈长梭形伸出细长突起，明显可见癌细胞彼此之间相互连接，细胞核分裂相增加。随着溶血磷脂酸浓度的增加，癌细胞的增殖和形态的改变逐渐显著。见封四图1 a～d。多西环素组的细胞数量明显减少，细胞群体数量
基金项目：广西卫生厅重点科研课题资助[合同号：重200946]。
作者简介：韦红卫（1965-），女（壮族），广西百色市人，主任医师，医学学士。Email：[email protected].
显著稀疏，形态轮廓变得不清晰，细胞明显皱缩变形，细胞间连接减少，胞体收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，少见核分裂相，细胞核内染色质向核膜聚集并呈凝块状，可见核碎裂，核处于溶解状态，并可见到发泡的凋亡小体。随着多西环素浓度增加，癌细胞的数量减少和形态破坏溶解逐渐显著，浓度达到40 mg/L时仅见到少量形态不完整或溶解破坏的细胞。见封四图2a～d。
2.电镜扫描结果与空白组相比，溶血磷脂酸组的细胞变得饱满，突起明显，细胞间连接十分密切，细胞表面出现大量的分泌颗粒。多西环素组则出现细胞皱缩，细胞核聚集呈凝块状，细胞处于溶解状态。见封四图3 a～c。讨论溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）是具有生长因子样作用的脂类小分子活性物质，是目前已知结构最简单的磷脂，LPA作为一种多功能“磷酸信使”，具有广泛的生物学效应如生长因子样作用、趋化作用、刺激血小板聚集及平滑肌收缩、促进神经递质的释放及细胞表面粘连蛋白的结合等。在生理情况下，LPA在血清中的浓度很低，为1～20 μmol/L，主要由血小板、成纤维母细胞、脂肪细胞、白细胞、内皮细胞、神经细胞等分泌，但在应激或病理状态下其血清浓度显著升高。近年来研究发现，LPA除了具有以上的生理功能外，在肿瘤的发生发展中亦发挥着重要的作用，如LPA能促进细胞有丝分裂，抑制肿瘤细胞凋亡，促进原位增殖；促进肿瘤血管生成；提高肿瘤细胞的迁移能力；促进癌栓的形成[2～4]。孙红等人报道LPA在体外能明显促进宫颈癌HeLa细胞的增殖，并呈剂量、时间依赖关系[5]。
Siha细胞是HPV阳性的宫颈癌细胞，癌细胞核仁大且数目多，核膜和核仁轮廓清楚，电镜下的超微结构特点是胞质低分化状态，含有大量的游离核糖体和部分多聚核糖体，内膜系统尤其是高尔基氏器不发达，微丝排列不够规律；细胞表面微绒毛增多变粗；细胞间连接较少。 本研究采用体外细胞培养PAS染色倒置显微镜和电镜扫描观察Siha细胞的形态变化，结果发现经 LPA处理过的Siha细胞增殖明显，细胞变形，形态不规则，细胞连接增加，细胞核体积增大，核分裂相增多，随着LPA浓度增加，细胞增殖及形态改变逐渐显著，提示LPA能明显促进Siha细胞的生长增殖，增强细胞间的连接及可塑性。电镜下还观察到经 LPA处理的Siha细胞表面有十分丰富的分泌颗粒，说明LPA能明显促进Siha细胞分泌某些物质，这些细胞分泌物可能与癌细胞的侵袭、转移有关。
多西环素作为一种抗生素已经广泛应用于临床，但最近的研究发现多西环素还具有强大的抗肿瘤作用，如直接细胞毒作用或诱导细胞凋亡、干扰肿瘤细胞外基质的重塑、抑制多种基质金属蛋白酶的活性和抗血管生成作用等[6]。本研究以多西环素为对照组，显微镜下观察见细胞数量明显减少、稀疏，细胞明显皱缩变形，细胞核处于溶解状态，表明多西环素能有效抑制宫颈癌Siha细胞的生长增殖，提示多西环素可能具有抑制宫颈癌发生、发展的作用，有可能成为宫颈癌药物治疗的一个新选择。
本研究在体外观察到了溶血磷脂酸和多西环素对Siha细胞形态学上的影响，这将为宫颈癌的药物治疗提供新的思路，但药物作用的分子生物学机制有待进一步研究。
参考文献
[1]宋水勤，张国楠.宫颈癌新辅助化疗现状[J].实用医院临床杂志，2005，2（2）：2225.
[2]刘玉萍，王颖钰，钱文慧，等.溶血磷脂酸（LPA） 对肿瘤转移的作用研究[J].中国药理学通报，2011，27（8）：10441047.
[3]Saunders JA，Rogers LC，Klomsiri C，et al.Reactive oxygen species mediate lysophosphatidic acid induced signaling in ovarian cancer cells[J].Free Radic Biol Med，2010，49（12）：20582067.
[4]Li ZG，Yu ZC，Yu YP，et al.Lysophosphatidic Acid level and the incidence of silent brain infarction in patients with nonvalvular atrial fibrillation[J].Int J Mol Sci， 2010，11（10）：39883998.
[5]孙红，朱青，任娟.溶血磷脂酸对宫颈癌细胞增殖、黏附、迁移和凋亡的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2009，25（8）：702704.
[6]董恒磊，孙保存，孙涛，等.多西环素抑制黑色素瘤细胞黏附的分子机制研究[J].中国肿瘤临床，2011，38（8）：426429.
（收稿日期：2013-04-03修回日期：2013-06-04）
（编辑：潘明志英文审校：梁宇）-±s）
右江医学2013年第41卷第3期Youjiang Medical Journal 2013，Vol.41 No.3右江医学2013年第41卷第3期Youjiang Medical Journal 2013，Vol.41 No.3
【关键词】溶血磷脂酸；宫颈癌；细胞形态
文章编号：1003-1383（2013）03-0323-03中图分类号：R737.33文献标识码：A
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在发展中国家其发病率位居女性恶性肿瘤之首。长期以来宫颈癌主要的治疗手段包括手术治疗和放疗，但由于受到远处转移和局部复发的制约，其治疗效果并不理想，总的5年生存率仍徘徊在40%左右[1]。因此寻找新的更有效的化疗药物，解决宫颈癌的浸润、转移问题成为目前研究的热点。本研究通过体外试验，观察激动剂溶血磷脂酸和抑制剂多西环素对宫颈癌细胞株Siha生长增殖的影响，为进一步研究宫颈癌浸润、转移和寻找药物作用的新靶点提供试验基础和理论依据。材料与方法1.材料人宫颈癌细胞株Siha购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，溶血磷脂酸购自Cayman公司，多西环素购自生工生物工程（上海）有限公司。
2.方法
（1）细胞培养：宫颈癌细胞株Siha常规培养于含有10%小牛血清、50 IU/ml青霉素和50 mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，在37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养。取生长状态良好的Siha细胞，以每孔1×104的密度进行细胞爬片，24 h后弃去培养液。然后溶血磷脂酸组各孔分别加入溶血磷脂酸终浓度为1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L的培养液，多西环素组各孔加入多西环素终浓度分别为5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L的培养液，空白组用RPMI 1640细胞培养液处理。各组继续培养72小时进行过碘酸雪夫氏（PAS）染色，在倒置显微镜下观察细胞形态。
（2）扫描电镜：取生长状态良好的Siha细胞，以1×106密度进行细胞爬片，12 h后细胞贴壁，溶血磷脂酸组加入溶血磷脂酸终浓度为10 μmol/L的培养液、多西环素组加入多西环素终浓度为40 mg/L的培养液、空白组用RPMI 1640细胞培养液处理，72 h后用固定液4℃避光固定过夜，电镜扫描。结果 1.宫颈癌Siha细胞体外培养形态观察在倒置显微镜下观察，可见空白组细胞平铺贴壁生长，呈梭形，细胞饱满，轮廓清晰，细胞之间排列密集，细胞间无接触抑制，多见分裂相细胞。经溶血磷脂酸干预后细胞数量明显增多，胞浆丰富，癌细胞变为多边形，彼此之间呈镶嵌样生长，部分细胞呈长梭形伸出细长突起，明显可见癌细胞彼此之间相互连接，细胞核分裂相增加。随着溶血磷脂酸浓度的增加，癌细胞的增殖和形态的改变逐渐显著。见封四图1 a～d。多西环素组的细胞数量明显减少，细胞群体数量
基金项目：广西卫生厅重点科研课题资助[合同号：重200946]。
作者简介：韦红卫（1965-），女（壮族），广西百色市人，主任医师，医学学士。Email：[email protected].
显著稀疏，形态轮廓变得不清晰，细胞明显皱缩变形，细胞间连接减少，胞体收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，少见核分裂相，细胞核内染色质向核膜聚集并呈凝块状，可见核碎裂，核处于溶解状态，并可见到发泡的凋亡小体。随着多西环素浓度增加，癌细胞的数量减少和形态破坏溶解逐渐显著，浓度达到40 mg/L时仅见到少量形态不完整或溶解破坏的细胞。见封四图2a～d。
2.电镜扫描结果与空白组相比，溶血磷脂酸组的细胞变得饱满，突起明显，细胞间连接十分密切，细胞表面出现大量的分泌颗粒。多西环素组则出现细胞皱缩，细胞核聚集呈凝块状，细胞处于溶解状态。见封四图3 a～c。讨论溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）是具有生长因子样作用的脂类小分子活性物质，是目前已知结构最简单的磷脂，LPA作为一种多功能“磷酸信使”，具有广泛的生物学效应如生长因子样作用、趋化作用、刺激血小板聚集及平滑肌收缩、促进神经递质的释放及细胞表面粘连蛋白的结合等。在生理情况下，LPA在血清中的浓度很低，为1～20 μmol/L，主要由血小板、成纤维母细胞、脂肪细胞、白细胞、内皮细胞、神经细胞等分泌，但在应激或病理状态下其血清浓度显著升高。近年来研究发现，LPA除了具有以上的生理功能外，在肿瘤的发生发展中亦发挥着重要的作用，如LPA能促进细胞有丝分裂，抑制肿瘤细胞凋亡，促进原位增殖；促进肿瘤血管生成；提高肿瘤细胞的迁移能力；促进癌栓的形成[2～4]。孙红等人报道LPA在体外能明显促进宫颈癌HeLa细胞的增殖，并呈剂量、时间依赖关系[5]。
Siha细胞是HPV阳性的宫颈癌细胞，癌细胞核仁大且数目多，核膜和核仁轮廓清楚，电镜下的超微结构特点是胞质低分化状态，含有大量的游离核糖体和部分多聚核糖体，内膜系统尤其是高尔基氏器不发达，微丝排列不够规律；细胞表面微绒毛增多变粗；细胞间连接较少。 本研究采用体外细胞培养PAS染色倒置显微镜和电镜扫描观察Siha细胞的形态变化，结果发现经 LPA处理过的Siha细胞增殖明显，细胞变形，形态不规则，细胞连接增加，细胞核体积增大，核分裂相增多，随着LPA浓度增加，细胞增殖及形态改变逐渐显著，提示LPA能明显促进Siha细胞的生长增殖，增强细胞间的连接及可塑性。电镜下还观察到经 LPA处理的Siha细胞表面有十分丰富的分泌颗粒，说明LPA能明显促进Siha细胞分泌某些物质，这些细胞分泌物可能与癌细胞的侵袭、转移有关。
多西环素作为一种抗生素已经广泛应用于临床，但最近的研究发现多西环素还具有强大的抗肿瘤作用，如直接细胞毒作用或诱导细胞凋亡、干扰肿瘤细胞外基质的重塑、抑制多种基质金属蛋白酶的活性和抗血管生成作用等[6]。本研究以多西环素为对照组，显微镜下观察见细胞数量明显减少、稀疏，细胞明显皱缩变形，细胞核处于溶解状态，表明多西环素能有效抑制宫颈癌Siha细胞的生长增殖，提示多西环素可能具有抑制宫颈癌发生、发展的作用，有可能成为宫颈癌药物治疗的一个新选择。
本研究在体外观察到了溶血磷脂酸和多西环素对Siha细胞形态学上的影响，这将为宫颈癌的药物治疗提供新的思路，但药物作用的分子生物学机制有待进一步研究。
参考文献
[1]宋水勤，张国楠.宫颈癌新辅助化疗现状[J].实用医院临床杂志，2005，2（2）：2225.
[2]刘玉萍，王颖钰，钱文慧，等.溶血磷脂酸（LPA） 对肿瘤转移的作用研究[J].中国药理学通报，2011，27（8）：10441047.
[3]Saunders JA，Rogers LC，Klomsiri C，et al.Reactive oxygen species mediate lysophosphatidic acid induced signaling in ovarian cancer cells[J].Free Radic Biol Med，2010，49（12）：20582067.
[4]Li ZG，Yu ZC，Yu YP，et al.Lysophosphatidic Acid level and the incidence of silent brain infarction in patients with nonvalvular atrial fibrillation[J].Int J Mol Sci， 2010，11（10）：39883998.
[5]孙红，朱青，任娟.溶血磷脂酸对宫颈癌细胞增殖、黏附、迁移和凋亡的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2009，25（8）：702704.
[6]董恒磊，孙保存，孙涛，等.多西环素抑制黑色素瘤细胞黏附的分子机制研究[J].中国肿瘤临床，2011，38（8）：426429.
（收稿日期：2013-04-03修回日期：2013-06-04）
（编辑：潘明志英文审校：梁宇）-±s）
右江医学2013年第41卷第3期Youjiang Medical Journal 2013，Vol.41 No.3右江医学2013年第41卷第3期Youjiang Medical Journal 2013，Vol.41 No.3