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摘 要：目的：建立果酱中6种合成着色剂的高效液相色谱测定方法。方法：样品经70 ℃的热水浸泡、提取后，加入一定浓度的氢氧化钠和硫酸锌溶液沉淀，定容后离心，最后取上清液过膜上机。以乙酸铵（0.02 mol/L）-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，紫外分光光度计检测，外标法定量。结果：6种合成着色剂在3个浓度的添加水平下，回收率为88%～102%，相对标准偏差为1.0%～3.7%，在0.1～50.0 μg/mL的浓度范围下呈现良好的线性关系，R2≥0.999。亮蓝检出限为1.0 mg/kg，柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和诱惑红的检出限均为0.5 mg/kg。
关键词：着色剂;果酱;高效液相色谱法
天然着色剂安全、成本高，而合成着色剂价格便宜且效果明显，所以更多商家选择使用合成着色剂。但合成着色剂不仅没有营养价值，过多使用还会对人体健康造成一定的威胁[1-2]，所以我国对其在食品中的使用作了明确的规定[3]。目前，国家标准规定的合成着色剂检测方法主要是高效液相色谱法[4]和纸色谱法[5]，但是这两种方法的前处理过程不一样，检测条件不同，步骤烦琐。国家标准没有针对果酱制品提出具体的前处理方法，而且对果酱中合成着色剂的研究也暂未见报道，所以针对果酱中常用着色剂，非常有必要研究一种操作简便又能够满足于检验机构日常检测任务的前处理方法，提高工作效率。
1 材料与方法
1.1 试剂
甲醇（CH3OH）：色谱纯;乙酸铵（CH3COONH4）：分析纯;氢氧化钠（NaOH）：分析纯;硫酸锌（ZnSO4）：分析纯;实验用水：超纯水。
柠檬黄（CAS：1934-21-0）、苋菜红（CAS：915-67-3）、胭脂红（CAS：2611-82-7）、日落黄（CAS：2783-94-0）、诱惑红（CAS：25956-17-6）、亮蓝（CAS：3844-45-9）、购自中国计量科学研究院，浓度均为0.500 mg/mL。
1.2 仪器和设备
LC-2010AHT高效液相色谱仪配紫外检测器（日本岛津公司）;AR224CN型天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）：感量为0.000 1 g;HH-2型恒温水浴锅（常州澳华）;KQ-500E型超声清洗器（昆山超声）。
1.3 实验方法
1.3.1 样品前处理
称取约5 g（精确至0.000 1 g）经粉碎均匀的样品，放入80 mL的小烧杯中，加水20 mL，用玻璃棒搅拌后放入70 ℃的水浴锅中加热溶解30 min（不溶解的样品可以适当延长时间或提升温度至全部溶解），取出，冷却至室温后转移到50 mL带刻度的容量瓶中，加入1 mol/L的NaoH溶液5 mL，1 mol/L的硫酸锌溶液5 mL，定容50 mL。然后剧烈振摇10 s后，离心，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，进高效液相色谱仪分析。将样品提取液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，峰面积大小进行外标法定量。
1.3.2 标准溶液配制
（1）合成着色剂标准混合储备液（100 μg/mL）：各吸取0.5 mg/mL的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝和诱惑红标准原液2.0 mL，用超纯水定容至10.0 mL。
（2）合成着色剂标准使用液：吸取100 μg/mL标准混合储备液0.01 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和5.0 mL用超纯水定容至10.0 mL，配成每毫升相当0.1 μg、1.0 μg、2.0 μg、5.0 μg、10.0 μg、20.0 μg和50.0 μg的合成着色剂，经0.45 μm微孔滤膜过滤上机。
（3）乙酸铵溶液（0.02 mol/L）：称取1.54 g乙酸铵，加水至1 000 mL，溶解，经0.45 μm微孔滤膜过滤，超声脱气。氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取40 g氢氧化钠，加水至1 000 mL，溶解混匀。硫酸锌溶液（1 mol/L）：称取161 g硫酸锌，加水至1 000 mL，溶解混匀。
1.3.3 上机条件
色谱柱：C18柱，4.6 mm×250 mm×5 μm（岛津Ankylo C18）;流速：1.0 mL/min;检测波长：254 nm;柱温：30 ℃;进样量：10 μL;采用梯度洗脱，以乙酸铵（0.02 mol/L）-甲醇作为流动相，具体条件如表1。
1.3.4 结果计算
试样中着色剂含量的计算公式：
式中：X-试样中着色剂的含量，单位为g/kg;c-标准物质的浓度，单位为μg/mL，m-试样的质量，单位为mg;v-试样稀释总体积，单位为mL;1 000-换算系数。
2 结果与分析
2.1 线性方程及检出限
按照国家标准要求将标准物质配成0.1 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和50.0 μg/mL的系列浓度，以峰面积为纵坐标Y，着色剂的含量（μg/mL）為横坐标X绘制标准曲线，进行线性回归分析，回归方程如表1所示。在空白样品中添加适量混合标准中间溶液，按1.3.1的样品前处理步骤操作，以S/N=3，即以3倍信噪比计算检测限，结果见表2。
2.2 回收率及精密度
精密称取已知不含6大合成着色剂的果酱6份，每份约5 g，以2份为1组，每组分别精密加入标准原液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL，按1.3.1中的方法进行平行测定，计算加样回收率，6种合成着色剂的回收率为88%～102%，RSD为1.0%～3.7%，表明该方法准确度良好。
2.3 验证试验
抽取客户委托送样的10个批次样品作为代表，采取上述方法进行处理，结果如表4。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值均低于算术平均值10%，符合标准要求。10批次样品中，只有1批次（第10批）的样品因为误用了不得添加的诱惑红导致不合格，其余9批次均合格，与初测结果基本一致。
3 结论
本实验通过改变样品的前处理方法来同时测定6种合成着色剂，免去了吸附、洗脱、浓缩等烦琐的操作步骤，操作简单、试剂用量少，符合环保的原则;而且3 h就可以出结果，可实现批量化检测、快速高效。回收率在88%～102%，相对标准偏差为1.0%～3.7%，标准曲线呈现良好的线性关系，检出限也能达到国标要求，此法快速、准确、高效，可广泛应用于合成着色剂的检测。
参考文献
[1]丁成翔，代汉慧，陈冬东.六种着色剂毒性研究进展[J].检验检疫学刊，2009，19（2）：70-73.
[2]宋环.食品添加剂应用现状分析[J].科学教育，2010（5）：73-75.
[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.
[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定：GB 5009.35—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.
[5]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中诱惑红的测定：GB 5009.141—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.
关键词：着色剂;果酱;高效液相色谱法
天然着色剂安全、成本高，而合成着色剂价格便宜且效果明显，所以更多商家选择使用合成着色剂。但合成着色剂不仅没有营养价值，过多使用还会对人体健康造成一定的威胁[1-2]，所以我国对其在食品中的使用作了明确的规定[3]。目前，国家标准规定的合成着色剂检测方法主要是高效液相色谱法[4]和纸色谱法[5]，但是这两种方法的前处理过程不一样，检测条件不同，步骤烦琐。国家标准没有针对果酱制品提出具体的前处理方法，而且对果酱中合成着色剂的研究也暂未见报道，所以针对果酱中常用着色剂，非常有必要研究一种操作简便又能够满足于检验机构日常检测任务的前处理方法，提高工作效率。
1 材料与方法
1.1 试剂
甲醇（CH3OH）：色谱纯;乙酸铵（CH3COONH4）：分析纯;氢氧化钠（NaOH）：分析纯;硫酸锌（ZnSO4）：分析纯;实验用水：超纯水。
柠檬黄（CAS：1934-21-0）、苋菜红（CAS：915-67-3）、胭脂红（CAS：2611-82-7）、日落黄（CAS：2783-94-0）、诱惑红（CAS：25956-17-6）、亮蓝（CAS：3844-45-9）、购自中国计量科学研究院，浓度均为0.500 mg/mL。
1.2 仪器和设备
LC-2010AHT高效液相色谱仪配紫外检测器（日本岛津公司）;AR224CN型天平（奥豪斯仪器（常州）有限公司）：感量为0.000 1 g;HH-2型恒温水浴锅（常州澳华）;KQ-500E型超声清洗器（昆山超声）。
1.3 实验方法
1.3.1 样品前处理
称取约5 g（精确至0.000 1 g）经粉碎均匀的样品，放入80 mL的小烧杯中，加水20 mL，用玻璃棒搅拌后放入70 ℃的水浴锅中加热溶解30 min（不溶解的样品可以适当延长时间或提升温度至全部溶解），取出，冷却至室温后转移到50 mL带刻度的容量瓶中，加入1 mol/L的NaoH溶液5 mL，1 mol/L的硫酸锌溶液5 mL，定容50 mL。然后剧烈振摇10 s后，离心，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，进高效液相色谱仪分析。将样品提取液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，峰面积大小进行外标法定量。
1.3.2 标准溶液配制
（1）合成着色剂标准混合储备液（100 μg/mL）：各吸取0.5 mg/mL的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝和诱惑红标准原液2.0 mL，用超纯水定容至10.0 mL。
（2）合成着色剂标准使用液：吸取100 μg/mL标准混合储备液0.01 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和5.0 mL用超纯水定容至10.0 mL，配成每毫升相当0.1 μg、1.0 μg、2.0 μg、5.0 μg、10.0 μg、20.0 μg和50.0 μg的合成着色剂，经0.45 μm微孔滤膜过滤上机。
（3）乙酸铵溶液（0.02 mol/L）：称取1.54 g乙酸铵，加水至1 000 mL，溶解，经0.45 μm微孔滤膜过滤，超声脱气。氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取40 g氢氧化钠，加水至1 000 mL，溶解混匀。硫酸锌溶液（1 mol/L）：称取161 g硫酸锌，加水至1 000 mL，溶解混匀。
1.3.3 上机条件
色谱柱：C18柱，4.6 mm×250 mm×5 μm（岛津Ankylo C18）;流速：1.0 mL/min;检测波长：254 nm;柱温：30 ℃;进样量：10 μL;采用梯度洗脱，以乙酸铵（0.02 mol/L）-甲醇作为流动相，具体条件如表1。
1.3.4 结果计算
试样中着色剂含量的计算公式：
式中：X-试样中着色剂的含量，单位为g/kg;c-标准物质的浓度，单位为μg/mL，m-试样的质量，单位为mg;v-试样稀释总体积，单位为mL;1 000-换算系数。
2 结果与分析
2.1 线性方程及检出限
按照国家标准要求将标准物质配成0.1 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和50.0 μg/mL的系列浓度，以峰面积为纵坐标Y，着色剂的含量（μg/mL）為横坐标X绘制标准曲线，进行线性回归分析，回归方程如表1所示。在空白样品中添加适量混合标准中间溶液，按1.3.1的样品前处理步骤操作，以S/N=3，即以3倍信噪比计算检测限，结果见表2。
2.2 回收率及精密度
精密称取已知不含6大合成着色剂的果酱6份，每份约5 g，以2份为1组，每组分别精密加入标准原液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL，按1.3.1中的方法进行平行测定，计算加样回收率，6种合成着色剂的回收率为88%～102%，RSD为1.0%～3.7%，表明该方法准确度良好。
2.3 验证试验
抽取客户委托送样的10个批次样品作为代表，采取上述方法进行处理，结果如表4。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值均低于算术平均值10%，符合标准要求。10批次样品中，只有1批次（第10批）的样品因为误用了不得添加的诱惑红导致不合格，其余9批次均合格，与初测结果基本一致。
3 结论
本实验通过改变样品的前处理方法来同时测定6种合成着色剂，免去了吸附、洗脱、浓缩等烦琐的操作步骤，操作简单、试剂用量少，符合环保的原则;而且3 h就可以出结果，可实现批量化检测、快速高效。回收率在88%～102%，相对标准偏差为1.0%～3.7%，标准曲线呈现良好的线性关系，检出限也能达到国标要求，此法快速、准确、高效，可广泛应用于合成着色剂的检测。
参考文献
[1]丁成翔，代汉慧，陈冬东.六种着色剂毒性研究进展[J].检验检疫学刊，2009，19（2）：70-73.
[2]宋环.食品添加剂应用现状分析[J].科学教育，2010（5）：73-75.
[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.
[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定：GB 5009.35—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.
[5]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中诱惑红的测定：GB 5009.141—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.