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摘 要：目的：建立同时测定酱油中山梨酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸酯类防腐劑的气相色谱检测方法。方法：样品经过盐酸溶液酸化，加入乙酸乙酯提取，最后采用气相色谱-氢火焰离子化检测器进行定量分析。结果：本方法可在12 min内实现分离。各防腐剂检出限为1 μg/mL，相关系数均在0.999以上，在添加水平的回收率为95.7%～102%，相对标准偏差在1.3%～3.0%（n=6）。结论：该方法样品前处理简单快速，分析时间短，灵敏度、准确度和精密度均满足测定酱油中山梨酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸酯类的检测要求。
关键词：防腐剂;气相色谱;酱油
山梨酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸酯类是酱油生产中常用的防腐剂。山梨酸、苯甲酸属于酸型防腐剂，会对其他微生物酶系统的正常运转产生一定影响而产生抑菌作用，使微生物的繁殖受到抑制[1];对羟基苯甲酸酯（尼泊金酯）属于酯型防腐剂，酚羟基结构破坏微生物细胞膜，使细胞内蛋白质变性，可抑制微生物细胞呼吸酶系与电子传递酶系活性，从而达到抑菌防腐作用[2]，其抑菌作用随着醇烃基碳原子数的增加而增加，且碳链越长，毒性越小，用量越少[3]。过量使用防腐剂会对人体产生一定的伤害，在一定程度上抑制骨骼生长，危害肾、肝脏的健康[4]。有研究显示，对羟基苯甲酸酯类具有弱雌激素活性，损害人体身心健康[5]。我国食品安全国家标准GB 2760—2014规定，酱油中山梨酸、苯甲酸限值均为1.0 g/kg，对羟基苯甲酸酯类添加量≤0.25 g/kg。
目前，测定山梨酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸酯的方法众多，主要有现行的国家标准GB 5009.28—2016、GB 5009.31—2016和行业标准，包括液相色谱法[6]、气相色谱法[7]、气相色谱联用质谱法[8]、液相色谱联用质谱法[9]、毛细管电泳法[10]等。标准方法前处理步骤繁琐，而且分别采用两个标准方法才能完成测定，耗时长，不利于大批量样品的测定，所以有必要研究一种同时检测酱油中常用的6种防腐剂的快速方法。本文采用气相色谱法建立准确、高效、快速测定酱油的山梨酸、苯甲酸及4种对羟基苯甲酸酯的检测方法，为实验室检测和酱油企业的出厂检验提供实际参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器与设备
岛津GC-2010Plus气相色谱仪配氢火焰离子化检测器（FID），岛津企业管理（中国）有限公司;涡旋振荡器，德国IKA公司;高速冷冻离心机，曦玛离心机（扬州）有限公司;ME204E/02型电子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司。
1.1.2 材料与试剂
标准品：山梨酸（99.7%，Bepure）、苯甲酸（99.8%，Bepure）、对羟基苯甲酸甲酯（99.7%，Bepure）、对羟基苯甲酸乙酯（99.9%，Bepure）、对羟基苯甲酸丙酯（99.0%，Dr.Ehrenstorfer）和对羟基苯甲酸丁酯（99.9，ANPLE）。盐酸（分析纯）、乙酸乙酯（色谱纯），实验室用水为Milli-Q一级超纯水，实验中的样品均购于本地商店。
1.2 试验方法
1.2.1 溶液与标准品配制
盐酸溶液（1∶1）：量取250 mL浓盐酸，与250 mL水混匀配得。
标准储备液的配制：分别称取山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯各0.05 g，精确到0.000 1 g，用乙酸乙酯溶解后定容至50 mL，混匀后此时得1 000 μg/mL的混标溶液。
标准工作曲线的配制：分别准确吸取标准储备液0.25 mL、0.50 mL、1.25 mL、2.50 mL、5.00 mL于5个25 mL容量瓶，用乙酸乙酯稀释至刻度，得到浓度分别为10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL的标准混合工作液。
1.2.2 样品前处理
取均匀的酱油样品5 g（精确到0.001 g），置于50 mL比色管，加入2 mL 1∶1盐酸溶液，涡旋1 min，再准确加入10 mL乙酸乙酯，涡旋3 min。在6 000 r/min的转速下离心3 min，取上清液过0.22 μm的有机滤膜，供气相色谱分析。
1.2.3 气相色谱条件
色谱柱：HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;进样口：温度240 ℃;进样体积1 μL，分流进样，分流比10∶1，柱流量为1.0 L/min。柱温升温程序：初温80 ℃保持1 min，以15 ℃/min的速率升到210 ℃，再以20 ℃/min的速率升到240 ℃，保留4 min。氢火焰离子化检测器（FID）：温度280 ℃，氢气40 mL/min，空气350 mL/min;载气：高纯氮气;尾吹30 mL/min。
2 结果与分析
2.1 目标化合物的提取溶剂
按照1.2.2的前处理方法，分别选择乙腈、乙酸乙酯、乙醚、甲醇作为提取溶剂，考虑到6种防腐剂能溶于有机溶剂，而且样品中的杂质成分不容易被有机溶剂提取出来，因此本方法选用这4种溶剂作为考察对象。结果表明，乙醚回收率在60%～70%，由于乙醚的沸点较低，提取时易挥发，导致回收率不理想。而甲醇与酱油中的水分会有一定程度的混溶，不易与水相分层，不考虑选用。乙腈和乙酸乙酯提取效果相近，能满足6种防腐剂的回收率要求。考虑到乙腈的毒性比乙酸乙酯大，最终选用乙酸乙酯作为理想的提取溶剂。
2.2 色谱柱的选择
本方法对2种不同类型的柱子对6种防腐剂在分离度、响应和峰形的方面进行评估比较，用于探究适合该方法检测的色谱柱。柱子分别选用HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）和HP-1（30 m×0.25 mm×0.25 μm），依照1.2.3的仪器条件，配置一个浓度为100 μg/mL的混标标点，分别用上述两条柱子上机检测。结果发现，这两条柱子都能将6种防腐剂实现分离;各防腐剂在HP-5柱的响应值普遍比在HP-1的高12%;峰形方面，选用HP-1柱的峰形会出现目标峰拖尾的现象，尤其是山梨酸和苯甲酸。HP-5柱得到的目标化合物峰形对称，基线平稳。综上，决定选用HP-5作为色谱柱进行测定。所得到的6种防腐剂色谱图见图1。 2.3 方法的线性范围及检出限
以化合物峰面積（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制6种防腐剂的标准曲线。其线性回归方程和相关系数如表1所示。结果表明，6种防腐剂在10～200 μg/mL的范围线性关系良好，线性系数均在0.999以上;逐级稀释标准品储备液，以信噪比S/N=3时的浓度为本方法的检出限，各防腐剂的检出限同见表1，均为1 μg/mL。
2.4 样品加标回收实验和重复性实验
称取从市场购买的酱油样品，在样品中分别添加低、中、高3个梯度浓度水平，以探究6种防腐剂的加标回收率，结果见表2;在同一添加水平下对样品进行6次平行测试实验，探究该方法的精密度情况，如表3所示。6种防腐剂的加标回收率在95.7%～102%，RSD为1.3%～3.0%，说明该方法的加标回收率和精密度良好。
2.5 实际样品的测定结果
从市面上购买不同厂家不同等级的酱油，覆盖4个等级，每个等级2个样品，共8批样品，用1.2中方法对样品进行测定，具体测定结果见表4，可知不同等级的酱油各项防腐剂使用量均符合GB 2760—2014的限量规定，使用总量都在0.3～0.6 g/kg。
3 结论
山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸酯类是酱油最常添加的几类防腐剂。本方法采用气相色谱仪分析，对前处理、色谱柱方面进行优化，解决了标准方法前处理步骤繁琐，成本高的问题，本方法同时测定山梨酸、苯甲酸和4种对羟基苯甲酸酯类，无需两个标准方法分别测定，节约了成本和时间。不仅可以将6种防腐剂实现分离，而且分析时间短，实验过程简便快捷，检出限低，回收率、精密度、准确度好，能满足实验室的检验要求，为酱油中防腐剂的测定提供了一个高效的测定方法。
参考文献
[1]刘天意，陈晓峰，姜睿祺.山梨酸钾的作用机理、毒性与检测方法综述[J].现代食品，2020（18）：96-98.
[2]董欣旖，赵英侠.食品防腐剂在食品中应用现状分析[J].中国食品添加剂，2020，31（11）：139-143.
[3]李卫华.毛细柱气相色谱法测定食品中对羟基苯甲酸酯类[J].粮食与油脂，2012，25（10）：28-31.
[4]魏玉芳.食品中苯甲酸、山梨酸的现状分析及检验方法研究[J].中国市场，2016（31）：295-296.
[5]SUGANDHA K， PHILIPPA D D. Parabens enable suspension growth of MCF - 10A immortalized， non-transformed human breast epithelial cells[J].Journal of Applied Toxicology，2013，33（5）：378-382.
[6]周纯洁，牟兴川，朱永红，等.高效液相色谱法同时测定酱油中13种防腐剂[J].中国调味品，2016，41（2）：107-109.
[7]陈利国，曹小彦，黄辉，等.毛细管气相色谱法直接测定食品中4种对羟基苯甲酸酯[J].食品与机械，2010，26（1）：
67-69.
[8]杨明，邵鹏，陈啟荣，等.固相萃取-气相色谱/质谱联用-内标法测定食品中9种防腐剂[J].分析试验室，2020，39（7）：834-838.
[9]芦春梅，张晓燕，赵庆松，等.高效液相色谱-串联质谱法测定糕点中四种尼泊金酯类防腐剂[J].食品工业，2013（7）：203-205.
[10]张礼春，曾凯，高舸，等.高效毛细管电泳法同时测定饮料中七种防腐剂[J].分析试验室，2015，34（1）：77-80.
关键词：防腐剂;气相色谱;酱油
山梨酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸酯类是酱油生产中常用的防腐剂。山梨酸、苯甲酸属于酸型防腐剂，会对其他微生物酶系统的正常运转产生一定影响而产生抑菌作用，使微生物的繁殖受到抑制[1];对羟基苯甲酸酯（尼泊金酯）属于酯型防腐剂，酚羟基结构破坏微生物细胞膜，使细胞内蛋白质变性，可抑制微生物细胞呼吸酶系与电子传递酶系活性，从而达到抑菌防腐作用[2]，其抑菌作用随着醇烃基碳原子数的增加而增加，且碳链越长，毒性越小，用量越少[3]。过量使用防腐剂会对人体产生一定的伤害，在一定程度上抑制骨骼生长，危害肾、肝脏的健康[4]。有研究显示，对羟基苯甲酸酯类具有弱雌激素活性，损害人体身心健康[5]。我国食品安全国家标准GB 2760—2014规定，酱油中山梨酸、苯甲酸限值均为1.0 g/kg，对羟基苯甲酸酯类添加量≤0.25 g/kg。
目前，测定山梨酸、苯甲酸和对羟基苯甲酸酯的方法众多，主要有现行的国家标准GB 5009.28—2016、GB 5009.31—2016和行业标准，包括液相色谱法[6]、气相色谱法[7]、气相色谱联用质谱法[8]、液相色谱联用质谱法[9]、毛细管电泳法[10]等。标准方法前处理步骤繁琐，而且分别采用两个标准方法才能完成测定，耗时长，不利于大批量样品的测定，所以有必要研究一种同时检测酱油中常用的6种防腐剂的快速方法。本文采用气相色谱法建立准确、高效、快速测定酱油的山梨酸、苯甲酸及4种对羟基苯甲酸酯的检测方法，为实验室检测和酱油企业的出厂检验提供实际参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器与设备
岛津GC-2010Plus气相色谱仪配氢火焰离子化检测器（FID），岛津企业管理（中国）有限公司;涡旋振荡器，德国IKA公司;高速冷冻离心机，曦玛离心机（扬州）有限公司;ME204E/02型电子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司。
1.1.2 材料与试剂
标准品：山梨酸（99.7%，Bepure）、苯甲酸（99.8%，Bepure）、对羟基苯甲酸甲酯（99.7%，Bepure）、对羟基苯甲酸乙酯（99.9%，Bepure）、对羟基苯甲酸丙酯（99.0%，Dr.Ehrenstorfer）和对羟基苯甲酸丁酯（99.9，ANPLE）。盐酸（分析纯）、乙酸乙酯（色谱纯），实验室用水为Milli-Q一级超纯水，实验中的样品均购于本地商店。
1.2 试验方法
1.2.1 溶液与标准品配制
盐酸溶液（1∶1）：量取250 mL浓盐酸，与250 mL水混匀配得。
标准储备液的配制：分别称取山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯各0.05 g，精确到0.000 1 g，用乙酸乙酯溶解后定容至50 mL，混匀后此时得1 000 μg/mL的混标溶液。
标准工作曲线的配制：分别准确吸取标准储备液0.25 mL、0.50 mL、1.25 mL、2.50 mL、5.00 mL于5个25 mL容量瓶，用乙酸乙酯稀释至刻度，得到浓度分别为10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL的标准混合工作液。
1.2.2 样品前处理
取均匀的酱油样品5 g（精确到0.001 g），置于50 mL比色管，加入2 mL 1∶1盐酸溶液，涡旋1 min，再准确加入10 mL乙酸乙酯，涡旋3 min。在6 000 r/min的转速下离心3 min，取上清液过0.22 μm的有机滤膜，供气相色谱分析。
1.2.3 气相色谱条件
色谱柱：HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;进样口：温度240 ℃;进样体积1 μL，分流进样，分流比10∶1，柱流量为1.0 L/min。柱温升温程序：初温80 ℃保持1 min，以15 ℃/min的速率升到210 ℃，再以20 ℃/min的速率升到240 ℃，保留4 min。氢火焰离子化检测器（FID）：温度280 ℃，氢气40 mL/min，空气350 mL/min;载气：高纯氮气;尾吹30 mL/min。
2 结果与分析
2.1 目标化合物的提取溶剂
按照1.2.2的前处理方法，分别选择乙腈、乙酸乙酯、乙醚、甲醇作为提取溶剂，考虑到6种防腐剂能溶于有机溶剂，而且样品中的杂质成分不容易被有机溶剂提取出来，因此本方法选用这4种溶剂作为考察对象。结果表明，乙醚回收率在60%～70%，由于乙醚的沸点较低，提取时易挥发，导致回收率不理想。而甲醇与酱油中的水分会有一定程度的混溶，不易与水相分层，不考虑选用。乙腈和乙酸乙酯提取效果相近，能满足6种防腐剂的回收率要求。考虑到乙腈的毒性比乙酸乙酯大，最终选用乙酸乙酯作为理想的提取溶剂。
2.2 色谱柱的选择
本方法对2种不同类型的柱子对6种防腐剂在分离度、响应和峰形的方面进行评估比较，用于探究适合该方法检测的色谱柱。柱子分别选用HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）和HP-1（30 m×0.25 mm×0.25 μm），依照1.2.3的仪器条件，配置一个浓度为100 μg/mL的混标标点，分别用上述两条柱子上机检测。结果发现，这两条柱子都能将6种防腐剂实现分离;各防腐剂在HP-5柱的响应值普遍比在HP-1的高12%;峰形方面，选用HP-1柱的峰形会出现目标峰拖尾的现象，尤其是山梨酸和苯甲酸。HP-5柱得到的目标化合物峰形对称，基线平稳。综上，决定选用HP-5作为色谱柱进行测定。所得到的6种防腐剂色谱图见图1。 2.3 方法的线性范围及检出限
以化合物峰面積（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制6种防腐剂的标准曲线。其线性回归方程和相关系数如表1所示。结果表明，6种防腐剂在10～200 μg/mL的范围线性关系良好，线性系数均在0.999以上;逐级稀释标准品储备液，以信噪比S/N=3时的浓度为本方法的检出限，各防腐剂的检出限同见表1，均为1 μg/mL。
2.4 样品加标回收实验和重复性实验
称取从市场购买的酱油样品，在样品中分别添加低、中、高3个梯度浓度水平，以探究6种防腐剂的加标回收率，结果见表2;在同一添加水平下对样品进行6次平行测试实验，探究该方法的精密度情况，如表3所示。6种防腐剂的加标回收率在95.7%～102%，RSD为1.3%～3.0%，说明该方法的加标回收率和精密度良好。
2.5 实际样品的测定结果
从市面上购买不同厂家不同等级的酱油，覆盖4个等级，每个等级2个样品，共8批样品，用1.2中方法对样品进行测定，具体测定结果见表4，可知不同等级的酱油各项防腐剂使用量均符合GB 2760—2014的限量规定，使用总量都在0.3～0.6 g/kg。
3 结论
山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸酯类是酱油最常添加的几类防腐剂。本方法采用气相色谱仪分析，对前处理、色谱柱方面进行优化，解决了标准方法前处理步骤繁琐，成本高的问题，本方法同时测定山梨酸、苯甲酸和4种对羟基苯甲酸酯类，无需两个标准方法分别测定，节约了成本和时间。不仅可以将6种防腐剂实现分离，而且分析时间短，实验过程简便快捷，检出限低，回收率、精密度、准确度好，能满足实验室的检验要求，为酱油中防腐剂的测定提供了一个高效的测定方法。
参考文献
[1]刘天意，陈晓峰，姜睿祺.山梨酸钾的作用机理、毒性与检测方法综述[J].现代食品，2020（18）：96-98.
[2]董欣旖，赵英侠.食品防腐剂在食品中应用现状分析[J].中国食品添加剂，2020，31（11）：139-143.
[3]李卫华.毛细柱气相色谱法测定食品中对羟基苯甲酸酯类[J].粮食与油脂，2012，25（10）：28-31.
[4]魏玉芳.食品中苯甲酸、山梨酸的现状分析及检验方法研究[J].中国市场，2016（31）：295-296.
[5]SUGANDHA K， PHILIPPA D D. Parabens enable suspension growth of MCF - 10A immortalized， non-transformed human breast epithelial cells[J].Journal of Applied Toxicology，2013，33（5）：378-382.
[6]周纯洁，牟兴川，朱永红，等.高效液相色谱法同时测定酱油中13种防腐剂[J].中国调味品，2016，41（2）：107-109.
[7]陈利国，曹小彦，黄辉，等.毛细管气相色谱法直接测定食品中4种对羟基苯甲酸酯[J].食品与机械，2010，26（1）：
67-69.
[8]杨明，邵鹏，陈啟荣，等.固相萃取-气相色谱/质谱联用-内标法测定食品中9种防腐剂[J].分析试验室，2020，39（7）：834-838.
[9]芦春梅，张晓燕，赵庆松，等.高效液相色谱-串联质谱法测定糕点中四种尼泊金酯类防腐剂[J].食品工业，2013（7）：203-205.
[10]张礼春，曾凯，高舸，等.高效毛细管电泳法同时测定饮料中七种防腐剂[J].分析试验室，2015，34（1）：77-80.