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摘 要：为了解2020年上海市青浦区肉制品中单增李斯特菌的污染状况、分子分型及耐药情况，按照《国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》检测肉制品中的单增李斯特菌，使用微量肉汤稀释法（MIC法）进行抗菌药物敏感性试验，应用PFGE分子分型并采用 BioNumerics软件分析聚类。结果显示，111份肉制品中单增李斯特菌的检出率为12.61%，生、熟肉制品的检出率存在统计学差异（χc2=29.09，P<0.05）。药敏试验表明，一株菌多重耐药——所有株菌对头孢西丁均耐药（100%），其次为苯唑西林（21.43%）。PFGE结果表明，LM聚类分析呈整体多态性且无聚集。结论为，2020年上海市青浦区肉制品中，鸡肉类生肉制品的单增李斯特菌污染情况严重，对头孢西丁完全耐药，极个别菌株存在多重耐药率。此外，分型带型存在多态性，为散发污染。因此，应加强对肉制品的安全监测，关注耐药菌株发展趋势，预防爆发性食品安全事件。
关键词：单增李斯特菌 食品 脉冲场凝胶电泳 耐药性
单增李斯特菌（Lesteria monocytogenes，以下简称“LM”）是革兰氏染色阳性短杆菌，也是李斯特菌属最具危害性的一种人畜共患食源性致病菌[1]，其能够引起人类严重感染一系列疾病，如脑膜炎、败血症、肺炎、热性肠胃炎、流产等[2]。LM广泛分布于自然界中，可在低温、高渗透压[3]、冷冻[4]等恶劣环境中生存，是低温冷藏食品的重要污染致病菌。本研究对2020年上海市青浦区肉制品中LM的感染现况、分子分型及耐药性进行分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 樣品采集
2020年1～12月，从上海市青浦区各零售渠道抽取111份肉制品，其中熟肉制品84份，生肉制品27份。
1.1.2 试剂与仪器
李氏增菌肉汤（LB）及相应添加剂、木糖发酵管、鼠李糖发酵管、TSA培养基，均购自青岛海博;李斯特显色平板、PALCAM平板、血琼脂平板，均购自科玛嘉;GP生化鉴定卡，购自法国梅里埃;以上均在有效期内。
VITEK 2 COMPACT，法国梅里埃;电泳仪、凝胶成像系统、PFGE及配套设备，均购自美国Bio-Rad。蛋白酶K（TAKARA）、限制性内切酶Asc I（TAKARA）、Seakem Gold琼脂糖（瑞士lonza）、96孔药敏板（珠海美华），均在有效期内。标准菌株：单核细胞李斯特氏菌CICC 21633，由CICC提供;脉冲场凝胶电泳所用Marker标准菌株沙门氏菌H9812，由上海市疾病预防控制中心提供。
1.2 方法
1.2.1 检测方法和药敏试验
按照《2020年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》规定来定性、定量检测LM，检出木糖-鼠李糖（阴性-阳性）发酵结果的可疑菌落，用VITEK 2 COMPACT仪器和GP生化鉴定卡鉴定LM菌株。检出的LM参照《2020年食源性疾病监测工作手册》和CLSI M45-A3，用MIC法进行耐药分析。
1.2.2 PFGE分型
参照美国疾病预防控制中心PFGE标准操作规程，对分离出的LM进行PFGE分子分型。以沙门氏菌（H9812）作为Marker，使用限制性内切酶Asc I（50U），37℃酶切2h。电泳参数：最小分子量49kb，最大分子量450kb，初始切换时间4.0s，最终切换时间40.0s;电压：6V;夹角：120°;运行时间：19h。电泳结束后，使用GelRed染料染色30min，于超纯水中脱色30min，然后使用Gel DocXR+凝胶成像系统读取并保存图谱，使用BioNumerics 7.6软件进行聚类分析，相似系数设置为Dice系数，优化1.5%，容忍度1.5%，聚类方法选择UPGMA。
1.3 统计学分析
用SPSS 18.0软件进行统计学分析。检出率的比较用χ2，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 总体检出情况
111份样品中，LM检出率为12.61%，两份样本中定量水平为60CFU/g。熟肉制品检出率为2.38%（2/84），生肉制品检出率为44.44%，两者检出率有统计学差异（χc2=29.09，P<0.05）。熟肉制品中畜类并未检出LM，菌株均来源于熟鸭肉。生肉制品中禽、畜类检出率无统计学差异（χ2=1.05，P>0.05）。生肉制品每月检出率相同，均为44.4%（4/9），主要以生鸡肉污染为主（54%，7/13），生猪肉次之（38%，3/8），生牛肉最少（33%，2/6）。
2.2 PFGE分型
14株LM使用Asc I酶切产生7～12条带，条带片段长度在25～1000kb范围内，共获得14种带型。聚类分析结果表明无本地优势带型，其中，QPLM20011/QPLM20013虽然为同一地点采集，但条带相似度低于60%，菌株聚类图详见图1。
2.3 耐药率比较
14株LM药敏结果显示，对头孢西丁均耐药（100.00%，14/14），3株LM对苯唑西林耐药（21.4%，3/14），仅有1株LM（QPLM20009，牛肉来源）存在多重耐药（头孢西丁、苯唑西林、四环素和克林霉素），见表2。
3 讨论
约99%的LM被认为是食源性致病菌[5]，故完善LM在食品方面的各项研究具有重要意义。脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术作为菌株溯源和食源性疾病爆发调查的金标准，被广泛应用于LM分子分型。经研究发现，不同地区LM的耐药情况不同，即耐药性随时间推进会向着复杂化发展[6]。因此，从多角度持续追踪LM的污染现况对未来的疾病预防和控制工作具有预警和指示作用。 ①2020年上海市青浦区肉制品中LM检出率为12.61%，高于多地肉制品检出率[7-10]。该地区熟肉制品和生肉制品中均存在LM污染的情况，生肉制品中生鸡肉LM污染情况尤为严重，熟肉制品中LM污染均源自于熟鸭肉。因此，需加强对该地区肉制品中LM污染的监测，扩大覆盖范围和渠道。2019年起，全国多省市中少数具有检测能力的医院陆续开展LM专项检测，但目前仍缺乏全国范围的病例监测数据。我国缺乏LM的爆发报道[5]，原因可能为我国烹饪习惯、临床等未将LM纳入常规监测、LM定量结果低等。LM可在低温下生存，工具、操作者及环境均可造成污染[11]，且较低含量仍可对消费者产生食品安全隐患，故建议将LM检测纳入基层临床、公共卫生常规监测中，加强监管，及时预警爆发风险。
②PFGE使用Asc I酶切，条带分布均匀，容易识别且没有出现降解的情况[10]。PFGE图谱分析结果为菌株分型带型存在多态性、无聚集，提示青浦地区LM污染为散发污染。统一采样来源的菌株聚类分析条带相似度低，提示其来自于不同的污染来源，总体存在多种潜在风险，食源性LM分型数据库可对爆发事件提供线索。
③从耐药结果分析，LM涉及所有耐药物（头孢西丁、苯唑西林、克林霉素、四环素）且与临床首选用药（青霉素或氨苄西林）无重合[6]，故不影响临床治疗用药。大多数菌株对所测抗生素敏感，仅一株来源牛肉的LM存在多种耐药情况，需持续关注和了解本地区LM的耐药发展趋势，结合畜类养殖抗生素使用情况提供临床治疗用药建议。
随着人民生活水平的提高，肉制品已经频繁出现在人们的餐桌上。熟肉制品需重视流通环节防污染、熟食吃前再加工等，并关注鸭肉类肉制品的安全风险。生肉制品虽已在食用前煮熟，但污染饮食环境的风险依然存在，因此，应关注生肉制品（尤其是鸡肉类）流通链上的安全风险和控制措施。同时，健全食品安全知识普及工作，提高大众对食品安全防范意识，有效降低食物中毒风险。
参考文献：
[1] Itumeleng Matle， Khanyisile R. Mbatha， Evelyn Madoroba. A review of Listeria monocytogenes from meat and meat products： Epidemiology， virulence factors， antimicrobial resistance and diagnosis[J].Onderstepoort Journal of Veterinary Research，2020， 87（1）：e1-e20.
[2] 杜冬冬，张奇文，李红欢，钱凌霄，马勋.单增李斯特菌lmo0331基因的克隆、序列分析及原核表达[J].中国畜牧兽医，2018，45（05）：1170-1176.
[3] ZOZ F，GRANDVALET C，LANG E，et al.Listeria monocytogenes ability to survive desiccation：influence of serotype，origin，virulence，and genotype[J].Int J Food Microbiol，2017，248：82-89.
[4] Caroline Willis， Jim McLauchlin， Heather Aird， et al. Occurrence of Listeria and Escherichia coli in frozen fruit and vegetables collected from retail and catering premises in England 2018-2019 .[J].International Journal of Food Microbiology， 2020：334.
[5] 張晓嫒，刘玉竹，张鹏航，王迪，马晓晨，陈倩.2019年北京市食源性单增李斯特菌的分子特征和耐药性研究[J].食品安全质量检测学报，2020，11（24）：9343-9348.
[6] 李庆辉，康立超，杜冬冬，李红欢，钱凌霄，刘扬扬，马勋.56株食源性单增李斯特菌耐药性测定及耐药基因的检测[J].中国兽医科学，2019，49（06）：766-772.
[7] 邵祥龙，章溢峰，傅灵菲，等.浦东新区2012-2014年市售生禽畜肉中沙门菌和单核细胞增生性李斯特菌污染情况分析[J].中国卫生检验杂志，2016，26（11）：1588-1593.
[8] 苏春丽，沈亮，杨柳.2012年成都市食源性致病菌污染状况调查分析[J].现代预防医学，2015，42（5）：817-818，840.
[9] 王闻卿，张勇，赵冰，苏靖华，黄红，张勇琪，朱林英，傅益飞，孙乔.上海市浦东新区生鲜食品中食源性致病菌监测[J].中国食品卫生杂志，2016，28（06）：791-795.
[10] 俞骅，郑伟，王艳，金东，斯国静，潘劲草.2007年-2011年杭州地区食品中单核细胞增生李斯特菌PFGE型别分析[J].中国卫生检验杂志，2013，23（05）：1189-1192.
[11] 李可维，刘思洁，赵薇，杨修军，石奔，孙景昱.9274份肉及肉制品食源性致病菌监测结果分析[J].食品安全质量检测学报，2020，11（23）：9033-9038.
作者简介：卢晓芸，女，初级检验技师，主要从事食品安全卫生与食源性疾病防治。
关键词：单增李斯特菌 食品 脉冲场凝胶电泳 耐药性
单增李斯特菌（Lesteria monocytogenes，以下简称“LM”）是革兰氏染色阳性短杆菌，也是李斯特菌属最具危害性的一种人畜共患食源性致病菌[1]，其能够引起人类严重感染一系列疾病，如脑膜炎、败血症、肺炎、热性肠胃炎、流产等[2]。LM广泛分布于自然界中，可在低温、高渗透压[3]、冷冻[4]等恶劣环境中生存，是低温冷藏食品的重要污染致病菌。本研究对2020年上海市青浦区肉制品中LM的感染现况、分子分型及耐药性进行分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 樣品采集
2020年1～12月，从上海市青浦区各零售渠道抽取111份肉制品，其中熟肉制品84份，生肉制品27份。
1.1.2 试剂与仪器
李氏增菌肉汤（LB）及相应添加剂、木糖发酵管、鼠李糖发酵管、TSA培养基，均购自青岛海博;李斯特显色平板、PALCAM平板、血琼脂平板，均购自科玛嘉;GP生化鉴定卡，购自法国梅里埃;以上均在有效期内。
VITEK 2 COMPACT，法国梅里埃;电泳仪、凝胶成像系统、PFGE及配套设备，均购自美国Bio-Rad。蛋白酶K（TAKARA）、限制性内切酶Asc I（TAKARA）、Seakem Gold琼脂糖（瑞士lonza）、96孔药敏板（珠海美华），均在有效期内。标准菌株：单核细胞李斯特氏菌CICC 21633，由CICC提供;脉冲场凝胶电泳所用Marker标准菌株沙门氏菌H9812，由上海市疾病预防控制中心提供。
1.2 方法
1.2.1 检测方法和药敏试验
按照《2020年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》规定来定性、定量检测LM，检出木糖-鼠李糖（阴性-阳性）发酵结果的可疑菌落，用VITEK 2 COMPACT仪器和GP生化鉴定卡鉴定LM菌株。检出的LM参照《2020年食源性疾病监测工作手册》和CLSI M45-A3，用MIC法进行耐药分析。
1.2.2 PFGE分型
参照美国疾病预防控制中心PFGE标准操作规程，对分离出的LM进行PFGE分子分型。以沙门氏菌（H9812）作为Marker，使用限制性内切酶Asc I（50U），37℃酶切2h。电泳参数：最小分子量49kb，最大分子量450kb，初始切换时间4.0s，最终切换时间40.0s;电压：6V;夹角：120°;运行时间：19h。电泳结束后，使用GelRed染料染色30min，于超纯水中脱色30min，然后使用Gel DocXR+凝胶成像系统读取并保存图谱，使用BioNumerics 7.6软件进行聚类分析，相似系数设置为Dice系数，优化1.5%，容忍度1.5%，聚类方法选择UPGMA。
1.3 统计学分析
用SPSS 18.0软件进行统计学分析。检出率的比较用χ2，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 总体检出情况
111份样品中，LM检出率为12.61%，两份样本中定量水平为60CFU/g。熟肉制品检出率为2.38%（2/84），生肉制品检出率为44.44%，两者检出率有统计学差异（χc2=29.09，P<0.05）。熟肉制品中畜类并未检出LM，菌株均来源于熟鸭肉。生肉制品中禽、畜类检出率无统计学差异（χ2=1.05，P>0.05）。生肉制品每月检出率相同，均为44.4%（4/9），主要以生鸡肉污染为主（54%，7/13），生猪肉次之（38%，3/8），生牛肉最少（33%，2/6）。
2.2 PFGE分型
14株LM使用Asc I酶切产生7～12条带，条带片段长度在25～1000kb范围内，共获得14种带型。聚类分析结果表明无本地优势带型，其中，QPLM20011/QPLM20013虽然为同一地点采集，但条带相似度低于60%，菌株聚类图详见图1。
2.3 耐药率比较
14株LM药敏结果显示，对头孢西丁均耐药（100.00%，14/14），3株LM对苯唑西林耐药（21.4%，3/14），仅有1株LM（QPLM20009，牛肉来源）存在多重耐药（头孢西丁、苯唑西林、四环素和克林霉素），见表2。
3 讨论
约99%的LM被认为是食源性致病菌[5]，故完善LM在食品方面的各项研究具有重要意义。脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术作为菌株溯源和食源性疾病爆发调查的金标准，被广泛应用于LM分子分型。经研究发现，不同地区LM的耐药情况不同，即耐药性随时间推进会向着复杂化发展[6]。因此，从多角度持续追踪LM的污染现况对未来的疾病预防和控制工作具有预警和指示作用。 ①2020年上海市青浦区肉制品中LM检出率为12.61%，高于多地肉制品检出率[7-10]。该地区熟肉制品和生肉制品中均存在LM污染的情况，生肉制品中生鸡肉LM污染情况尤为严重，熟肉制品中LM污染均源自于熟鸭肉。因此，需加强对该地区肉制品中LM污染的监测，扩大覆盖范围和渠道。2019年起，全国多省市中少数具有检测能力的医院陆续开展LM专项检测，但目前仍缺乏全国范围的病例监测数据。我国缺乏LM的爆发报道[5]，原因可能为我国烹饪习惯、临床等未将LM纳入常规监测、LM定量结果低等。LM可在低温下生存，工具、操作者及环境均可造成污染[11]，且较低含量仍可对消费者产生食品安全隐患，故建议将LM检测纳入基层临床、公共卫生常规监测中，加强监管，及时预警爆发风险。
②PFGE使用Asc I酶切，条带分布均匀，容易识别且没有出现降解的情况[10]。PFGE图谱分析结果为菌株分型带型存在多态性、无聚集，提示青浦地区LM污染为散发污染。统一采样来源的菌株聚类分析条带相似度低，提示其来自于不同的污染来源，总体存在多种潜在风险，食源性LM分型数据库可对爆发事件提供线索。
③从耐药结果分析，LM涉及所有耐药物（头孢西丁、苯唑西林、克林霉素、四环素）且与临床首选用药（青霉素或氨苄西林）无重合[6]，故不影响临床治疗用药。大多数菌株对所测抗生素敏感，仅一株来源牛肉的LM存在多种耐药情况，需持续关注和了解本地区LM的耐药发展趋势，结合畜类养殖抗生素使用情况提供临床治疗用药建议。
随着人民生活水平的提高，肉制品已经频繁出现在人们的餐桌上。熟肉制品需重视流通环节防污染、熟食吃前再加工等，并关注鸭肉类肉制品的安全风险。生肉制品虽已在食用前煮熟，但污染饮食环境的风险依然存在，因此，应关注生肉制品（尤其是鸡肉类）流通链上的安全风险和控制措施。同时，健全食品安全知识普及工作，提高大众对食品安全防范意识，有效降低食物中毒风险。
参考文献：
[1] Itumeleng Matle， Khanyisile R. Mbatha， Evelyn Madoroba. A review of Listeria monocytogenes from meat and meat products： Epidemiology， virulence factors， antimicrobial resistance and diagnosis[J].Onderstepoort Journal of Veterinary Research，2020， 87（1）：e1-e20.
[2] 杜冬冬，张奇文，李红欢，钱凌霄，马勋.单增李斯特菌lmo0331基因的克隆、序列分析及原核表达[J].中国畜牧兽医，2018，45（05）：1170-1176.
[3] ZOZ F，GRANDVALET C，LANG E，et al.Listeria monocytogenes ability to survive desiccation：influence of serotype，origin，virulence，and genotype[J].Int J Food Microbiol，2017，248：82-89.
[4] Caroline Willis， Jim McLauchlin， Heather Aird， et al. Occurrence of Listeria and Escherichia coli in frozen fruit and vegetables collected from retail and catering premises in England 2018-2019 .[J].International Journal of Food Microbiology， 2020：334.
[5] 張晓嫒，刘玉竹，张鹏航，王迪，马晓晨，陈倩.2019年北京市食源性单增李斯特菌的分子特征和耐药性研究[J].食品安全质量检测学报，2020，11（24）：9343-9348.
[6] 李庆辉，康立超，杜冬冬，李红欢，钱凌霄，刘扬扬，马勋.56株食源性单增李斯特菌耐药性测定及耐药基因的检测[J].中国兽医科学，2019，49（06）：766-772.
[7] 邵祥龙，章溢峰，傅灵菲，等.浦东新区2012-2014年市售生禽畜肉中沙门菌和单核细胞增生性李斯特菌污染情况分析[J].中国卫生检验杂志，2016，26（11）：1588-1593.
[8] 苏春丽，沈亮，杨柳.2012年成都市食源性致病菌污染状况调查分析[J].现代预防医学，2015，42（5）：817-818，840.
[9] 王闻卿，张勇，赵冰，苏靖华，黄红，张勇琪，朱林英，傅益飞，孙乔.上海市浦东新区生鲜食品中食源性致病菌监测[J].中国食品卫生杂志，2016，28（06）：791-795.
[10] 俞骅，郑伟，王艳，金东，斯国静，潘劲草.2007年-2011年杭州地区食品中单核细胞增生李斯特菌PFGE型别分析[J].中国卫生检验杂志，2013，23（05）：1189-1192.
[11] 李可维，刘思洁，赵薇，杨修军，石奔，孙景昱.9274份肉及肉制品食源性致病菌监测结果分析[J].食品安全质量检测学报，2020，11（23）：9033-9038.
作者简介：卢晓芸，女，初级检验技师，主要从事食品安全卫生与食源性疾病防治。