【摘 要】
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目的:构建豆蔻酰化富丙氨酸激酶c底物(MARCKS)磷酸化位点(PSD)突变体,并探讨瞬时受体电位M8离子通道(TRPM8)及MARCKS在冷刺激诱导黏蛋白(MUC)5AC合成及胞吐过程中发挥的作用.
【机 构】
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重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心
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目的:构建豆蔻酰化富丙氨酸激酶c底物(MARCKS)磷酸化位点(PSD)突变体,并探讨瞬时受体电位M8离子通道(TRPM8)及MARCKS在冷刺激诱导黏蛋白(MUC)5AC合成及胞吐过程中发挥的作用.方法:利用PCR克隆全编码MARCKS目的基因,并通过定点突变技术将PSD的4个丝氨酸突变为天冬氨酸编码基因.将野生型及突变体cDNA亚克隆至pcDNA3.0载体后用酶切及DNA测序鉴定.以TRPM8特异性阻断剂BCTC、重组突变质粒转染人气道上皮16HBE细胞为干预手段,用免疫荧光及ELISA检测二者对冷空气刺激诱导的16HBE细胞合成及分泌MUC5AC的影响.结果:成功构建了pcDNA3.0-MARCKS重组质粒及pcDNA3.0-MARCKS-PSD突变体.冷刺激组胞内合成及分泌MUC5AC水平显著高于未刺激对照组(P＜0.05).与冷刺激组比较,BCTC可显著抑制由冷刺激诱导的MUC5AC合成及分泌(P＜0.05)；与冷刺激组比较,转染MARCKS-PSD突变cDNA可显著下调由冷刺激诱导的MUC5AC高分泌水平(P＜0.05),同时胞内的MUC5AC水平与对照组比较呈现显著升高状态(P＜0.01),而转染载体及野生型MARCKS对冷刺激诱导的MUC5AC胞内合成及胞外分泌水平无显著影响(p＞0.05).结论:TRPM8及MARCKSPSD的磷酸化过程介导了冷刺激诱导气道上皮细胞内MUC5AC的胞吐过程.
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