【摘 要】
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肝核因子3β(hepatocyte nuclear factor 3β,HNF 3β)作为一个重要的转录调控因子,参与哺乳动物的前肠胚和肝脏发育以及成体肝内的能量代谢,而HNF 3β在鸡(Gallus gallus)中的功能还不清楚.为研究鸡HNF 3β在肝内糖脂代谢中的作用提供有效的抗体,本研究优化合成了鸡Hnf 3β基因编码区片段,以pET 30a表达载体在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行重组蛋白HNF 3β的表达,用6 mol/L尿素变性包涵体,Ni2+对重组蛋白进行亲和层析,并以
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肝核因子3β(hepatocyte nuclear factor 3β,HNF 3β)作为一个重要的转录调控因子,参与哺乳动物的前肠胚和肝脏发育以及成体肝内的能量代谢,而HNF 3β在鸡(Gallus gallus)中的功能还不清楚.为研究鸡HNF 3β在肝内糖脂代谢中的作用提供有效的抗体,本研究优化合成了鸡Hnf 3β基因编码区片段,以pET 30a表达载体在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行重组蛋白HNF 3β的表达,用6 mol/L尿素变性包涵体,Ni2+对重组蛋白进行亲和层析,并以快速稀释法复性重组蛋白,以离心超滤法收集、浓缩目的蛋白;取纯化的HNF 3β重组蛋白和弗氏佐剂乳化后免疫兔(Oryctolagus cuniculus),制备鸡HNF 3β的抗血清,以酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定抗血清效价后,用Protein A法纯化抗体;通过检测鸡肝癌细胞系(leghorn male hepatoma,LMH)中HNF 3β蛋白的表达情况验证所制备抗体的效果.结果表明,优化合成的Hnf 3β基因片段在大肠杆菌中实现了重组蛋白的高效表达;在6 mol/L尿素的变性条件下,Ni2+亲和层析一步法获得纯度大于95％的重组蛋白,结合快速稀释法获得了可溶性的重组蛋白HNF 3β;经重组蛋白4次免疫后,抗血清效价超过1:64000;免疫印迹结果显示,制备的抗体能特异性的检测出LMH细胞中HNF 3β蛋白的表达.综上所述,本研究利用制备的高纯度重组蛋白HNF 3β免疫兔获得了高特异性和高效价的多克隆抗体,可以为检测鸡HNF 3β蛋白分子及研究其功能提供可靠的抗体.
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