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【摘 要】結肠癌是消化道肿瘤中发病率较高的恶性癌肿，早期发现、早期手术是延长生命、提高生活质量的关键。研究发现端粒酶（Telomerase）活性的检测对结肠癌早期诊断是非常有价值，血清癌胚抗原（CEA）检测对结肠癌早期诊断亦有辅助作用。本文通过对50例结肠癌组织中的端粒酶活性及血清CEA的检测，探讨它们在结肠癌诊断中的价值。
【中图分类号】R44 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0756—02
1 料和方法
1.1 临床资料
1.1.1 病例来源： 治疗组取自2010年1月-2012年10月吉林大学第一医院普外科结肠癌根治术的病人50例，男30例，女20例，平均年龄56.5±16.5岁。对照组为本院门诊镜检科行结肠镜检查的病人50例，诊断均为肠良性息肉，年龄与治疗组无显著差异。标本均于- 80℃液氮中保存备端粒酶活性检测。
1.1.2 病理类型及分期：50例结肠癌患者中： 腺癌22例，粘液癌13例，鳞状细胞癌15例；临床分期：Ⅰ期8例， Ⅱ24期例， Ⅲ期以上18例。50例门诊肠镜检查的病人肠息肉均为良性。
1.2 实验方法
端粒酶提取 取活检组织约48mg 在Ep试管中用PBS缓冲液去除污血，干净后匀浆，加入最为合适量的冷PBS于5-6℃静置片刻，取上清液180μL ，离心后收集细胞，立即加入裂解液30μL ，将其混匀，冰浴约40 min ，接着在4 ℃以14500 r/ min 离心9 min ，取上清液在- 20 ℃保存。
端粒酶活性检测 以PCR - TRAP 法检测端粒酶活性，其反应混合液中含18μL Tris - HCL （pH 7.9） ，1mmol/ L MgCl2 ，58 mmol/ L KCl ，0.01 % Tween 18 ，1.2 mmol/ LEGTA ，48 mmol/ LdNTP ，2μg T3 基因29 蛋白，BSA 0.12μg/ mL ，α-29p- dCTP 7.2 kBq ， Taq DNA 聚合酶3IU ， TS 引物0.22μg和蛋白提取物7μg ，高压后去离子水，至终体积30μL 。使其混匀，上层以石蜡油盖之，于37℃保温32 min。88℃3 min 灭活端粒酶，加CX引物0.009μg 行PCR 扩增，扩增条件：92℃变性3min ，94 ℃39 s ，48℃38 s ，69 ℃48s ，共32 循环；69℃延伸6min。取PCR 产物12μL ，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以X线胶片放射显影， - 79 ℃25～50 h 显示结果，出现7bp 梯形带为阳性，以7μg Hela 细胞蛋白为阳性对照。
1.3 血清CA19-9及CEA检测
血清CEA检测：取5ml外周血送中心实验室常规检测，CEA参考值为20 ng/m，如增高时提示消化道肿瘤阳性。
1.4 统计学方法 采用SAS 11.0 软件统计分析，组间比较用 X2 检验，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 端粒酶、血清CEA在结肠癌及肠息肉组织中的表达
端粒酶、血清血清CEA阳性率在结肠癌组织与肠息肉组织中比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。结肠癌组织中端粒酶阳性率虽高于CEA，但差异无显著性（P﹥0.05）。见表1。
2.2 端粒酶、血清CEA阳性率与结肠癌临床病理特性的关系
结肠癌患者端粒酶及CEA阳性率在不同分化程度差异无统计学意义（P﹥0.05）。结肠癌患者血清CEA阳性率在Ⅲ期-Ⅳ期明显增高，与Ⅰ期、Ⅱ期比较差异显著（P<0.05） 。见表2。
2.3 端粒酶、血清CEA在结肠癌组织中的联合表达情况
端粒酶、血清CEA在结肠癌组织表达呈正相关（P<0.05）。50例结肠癌中共有21例端粒酶、血清CEA同时呈阳性表达，晚期结肠癌病例同时呈阳性的比率增加。
3 讨论
端粒是真核细胞染色体末端的一个像帽子一样的特殊结构，由重复DNA序列及相关蛋白质组成。端粒DNA是由5′-CCCCAA-3′六碱基重复序列构成 ， 有保护染色体的作用[1] 端粒可通过t-loop形成紧凑结构[2]，避免染色体DNA降解，避免末端融合，避免非常规重组。随着随着体细胞的不断增殖，端粒长度会逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度，细胞停止了分裂，染色体的稳定性降低，则导致细胞凋亡[3]。
端粒酶是一种核糖核蛋白，通过引物特异识别位点，以自身RNA为模板，在染色体末端合成端粒DNA重复序列，延长了端粒，使细胞出现无限的增殖，进而产生癌肿细胞，故对癌肿的产生起着至关重要的作用[4]。它是一种由端粒酶RNA（hTR）、端粒酶相关蛋白1（hTEP1）和催化亚单位（hTERT）组成。在正常人体恶性肿瘤细胞中端粒酶检出率几乎为0，但在国外400多肿瘤样本中端粒酶检出率高达85%，而良性肿瘤中端粒酶检出率仅为3.5% [5]。因而端粒酶的高表达为我们对早期结肠癌的诊断提供了思路。本研究发现结肠癌早期端粒酶阳性率及晚期阳性率均不低于66.7%，一般高达73.2%以上；肠息肉组织的阳性率为4%。与国外研究大体相近，而端粒酶阳性率与结肠癌的分期及分化程度无关，提示端粒酶的检测可能是结肠癌的早期诊断指标之一。
癌胚抗原（CEA）起源于内胚叶，是一种糖蛋白，癌胚抗原是临床、实验室较为常用的检测癌肿的指标。在恶性肿瘤中CEA明显增高。
本研究显示结肠癌患者血清CEA阳性率在Ⅲ期-Ⅳ期明显增高，与Ⅰ期、Ⅱ期比差异显著（P<0.05） 。提示此种肿瘤标志物对早期结肠癌诊断灵敏度并不高，对进展期结肠癌诊断较好，端粒酶、血清CEA呈正相关，提示联合检测端粒酶、血清CEA对结肠癌的诊断有一定价值，对判断结肠癌的发展程度有帮助。
参考文献：
[1] Blackburn E H， Gall J G. A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena. J Mol Biol， 1978， 120（1）： 33～53
[2] Xu Y， Sato H， Shinohara K， et al. T-loop formation by human telomerec G-quadruplex. Nucleic Acids Symp Ser （Oxf）， 2007， （51）：243-244
[3] Artandi SE，Chang S，Lee SL，et al.Telomere dysfunction promotes nonreciprocal translocations and epithelial cancer in mice[J].Nature，2000，406（6796）：461-465.
[4] Beatty GL，Vonderheide RH.Telomerase as a universal tumor antigen for cancer vaccines[J].Expert Rev Vaccines，2008，7（7）：881.
[5] Rhyu M S. Telomeres， telomerase， and immortality. J Natl Cancer Inst， 1995， 87（12）： 884～894
【中图分类号】R44 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0756—02
1 料和方法
1.1 临床资料
1.1.1 病例来源： 治疗组取自2010年1月-2012年10月吉林大学第一医院普外科结肠癌根治术的病人50例，男30例，女20例，平均年龄56.5±16.5岁。对照组为本院门诊镜检科行结肠镜检查的病人50例，诊断均为肠良性息肉，年龄与治疗组无显著差异。标本均于- 80℃液氮中保存备端粒酶活性检测。
1.1.2 病理类型及分期：50例结肠癌患者中： 腺癌22例，粘液癌13例，鳞状细胞癌15例；临床分期：Ⅰ期8例， Ⅱ24期例， Ⅲ期以上18例。50例门诊肠镜检查的病人肠息肉均为良性。
1.2 实验方法
端粒酶提取 取活检组织约48mg 在Ep试管中用PBS缓冲液去除污血，干净后匀浆，加入最为合适量的冷PBS于5-6℃静置片刻，取上清液180μL ，离心后收集细胞，立即加入裂解液30μL ，将其混匀，冰浴约40 min ，接着在4 ℃以14500 r/ min 离心9 min ，取上清液在- 20 ℃保存。
端粒酶活性检测 以PCR - TRAP 法检测端粒酶活性，其反应混合液中含18μL Tris - HCL （pH 7.9） ，1mmol/ L MgCl2 ，58 mmol/ L KCl ，0.01 % Tween 18 ，1.2 mmol/ LEGTA ，48 mmol/ LdNTP ，2μg T3 基因29 蛋白，BSA 0.12μg/ mL ，α-29p- dCTP 7.2 kBq ， Taq DNA 聚合酶3IU ， TS 引物0.22μg和蛋白提取物7μg ，高压后去离子水，至终体积30μL 。使其混匀，上层以石蜡油盖之，于37℃保温32 min。88℃3 min 灭活端粒酶，加CX引物0.009μg 行PCR 扩增，扩增条件：92℃变性3min ，94 ℃39 s ，48℃38 s ，69 ℃48s ，共32 循环；69℃延伸6min。取PCR 产物12μL ，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以X线胶片放射显影， - 79 ℃25～50 h 显示结果，出现7bp 梯形带为阳性，以7μg Hela 细胞蛋白为阳性对照。
1.3 血清CA19-9及CEA检测
血清CEA检测：取5ml外周血送中心实验室常规检测，CEA参考值为20 ng/m，如增高时提示消化道肿瘤阳性。
1.4 统计学方法 采用SAS 11.0 软件统计分析，组间比较用 X2 检验，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 端粒酶、血清CEA在结肠癌及肠息肉组织中的表达
端粒酶、血清血清CEA阳性率在结肠癌组织与肠息肉组织中比较差异均有统计学意义（均P<0.05）。结肠癌组织中端粒酶阳性率虽高于CEA，但差异无显著性（P﹥0.05）。见表1。
2.2 端粒酶、血清CEA阳性率与结肠癌临床病理特性的关系
结肠癌患者端粒酶及CEA阳性率在不同分化程度差异无统计学意义（P﹥0.05）。结肠癌患者血清CEA阳性率在Ⅲ期-Ⅳ期明显增高，与Ⅰ期、Ⅱ期比较差异显著（P<0.05） 。见表2。
2.3 端粒酶、血清CEA在结肠癌组织中的联合表达情况
端粒酶、血清CEA在结肠癌组织表达呈正相关（P<0.05）。50例结肠癌中共有21例端粒酶、血清CEA同时呈阳性表达，晚期结肠癌病例同时呈阳性的比率增加。
3 讨论
端粒是真核细胞染色体末端的一个像帽子一样的特殊结构，由重复DNA序列及相关蛋白质组成。端粒DNA是由5′-CCCCAA-3′六碱基重复序列构成 ， 有保护染色体的作用[1] 端粒可通过t-loop形成紧凑结构[2]，避免染色体DNA降解，避免末端融合，避免非常规重组。随着随着体细胞的不断增殖，端粒长度会逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度，细胞停止了分裂，染色体的稳定性降低，则导致细胞凋亡[3]。
端粒酶是一种核糖核蛋白，通过引物特异识别位点，以自身RNA为模板，在染色体末端合成端粒DNA重复序列，延长了端粒，使细胞出现无限的增殖，进而产生癌肿细胞，故对癌肿的产生起着至关重要的作用[4]。它是一种由端粒酶RNA（hTR）、端粒酶相关蛋白1（hTEP1）和催化亚单位（hTERT）组成。在正常人体恶性肿瘤细胞中端粒酶检出率几乎为0，但在国外400多肿瘤样本中端粒酶检出率高达85%，而良性肿瘤中端粒酶检出率仅为3.5% [5]。因而端粒酶的高表达为我们对早期结肠癌的诊断提供了思路。本研究发现结肠癌早期端粒酶阳性率及晚期阳性率均不低于66.7%，一般高达73.2%以上；肠息肉组织的阳性率为4%。与国外研究大体相近，而端粒酶阳性率与结肠癌的分期及分化程度无关，提示端粒酶的检测可能是结肠癌的早期诊断指标之一。
癌胚抗原（CEA）起源于内胚叶，是一种糖蛋白，癌胚抗原是临床、实验室较为常用的检测癌肿的指标。在恶性肿瘤中CEA明显增高。
本研究显示结肠癌患者血清CEA阳性率在Ⅲ期-Ⅳ期明显增高，与Ⅰ期、Ⅱ期比差异显著（P<0.05） 。提示此种肿瘤标志物对早期结肠癌诊断灵敏度并不高，对进展期结肠癌诊断较好，端粒酶、血清CEA呈正相关，提示联合检测端粒酶、血清CEA对结肠癌的诊断有一定价值，对判断结肠癌的发展程度有帮助。
参考文献：
[1] Blackburn E H， Gall J G. A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena. J Mol Biol， 1978， 120（1）： 33～53
[2] Xu Y， Sato H， Shinohara K， et al. T-loop formation by human telomerec G-quadruplex. Nucleic Acids Symp Ser （Oxf）， 2007， （51）：243-244
[3] Artandi SE，Chang S，Lee SL，et al.Telomere dysfunction promotes nonreciprocal translocations and epithelial cancer in mice[J].Nature，2000，406（6796）：461-465.
[4] Beatty GL，Vonderheide RH.Telomerase as a universal tumor antigen for cancer vaccines[J].Expert Rev Vaccines，2008，7（7）：881.
[5] Rhyu M S. Telomeres， telomerase， and immortality. J Natl Cancer Inst， 1995， 87（12）： 884～894