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摘要：氨基甲酸酯类农药并不是剧毒化合物，但具有致癌性，国际癌症研究机构在2007年把氨基甲酸酯类列为2A类致癌物。本文以国标中的前处理方法--SPE固相萃取法与QuEChERS法进行比较，探讨水果中8种氨基甲酸酯类农药残留前处理方法应用的简便适应性。
关键词：SPE；QuEChERS；液相色谱-串联质谱；农药残留
一.引言
氨基甲酸酯类农药，无特殊气味，在酸性环境下稳定，遇碱分解，具有选择性强、高效、广谱、对人畜低毒、易分解和残毒少的特点，在农业、林业和牧业等方面得到了广泛的应用。联合国粮食及农业组织及世界卫生组织与联合食品添加剂专家委员会（专家委员会）曾在2005年进行有关氨基甲酸酯类农药评估，认为经食物（不包括酒精饮品）摄入的氨基甲酸酯类农药分量，对健康的影响并不大，但经食物和酒精饮品摄入的氨基甲酸酯类总量，则可能对健康构成潜在的风险。液相色谱-三重四级杆串联质谱灵敏度高，抗干扰能力好，是当前痕量分析比较理想的方法。但食品基质复杂，农药残留量低，干扰因素多，在用有机溶剂提取时，同时会将色素、淀粉等一起提取出来，这些杂质如果不经净化处理，在进入检测器时，严重影响被测物的准确性。因此，样品前处理中目标物的提取、净化的方法选择优化，是农药多残留检测的关键步骤。
目前，已经广泛应该用于实际操作的前处理方法有固相萃取SPE，固相微萃取SPME，凝胶渗透色谱GPC，超临界流体萃取SFE等。2003年，美国农业部Anastassiades教授等开发了一种新的样品前处理技术--QuEChERS方法，是一种用于农产品检测的快速样品前处理技术。其原理与高效液相色谱和固相萃取（SPE）相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。QuEChERS方法不需要经过传统前处理的提取浓缩干燥、过固相柱净化等步骤，实际应用中更为简便。[1]本文选择用苹果作为代表基质，探讨SPE法与QuEChERS方法对水果中氨基甲酸酯类农药的应用适应性。
二.实验部分
2.1仪器与试剂
液相色谱-串联质谱仪：HPLC1200安捷伦液相色谱；API4000Q质谱仪配电喷雾离子源（ESI）；高速分散均质机（德国IKA）；上海亚荣RE3000旋转蒸发仪配套真空循环水泵；涡旋振荡器；湖南赫西离心机；上海安亭高速离心机；智真全自动固相萃取仪。
乙腈（色谱纯），甲酸（HPLC级），PSA 吸附剂；
无水硫酸镁（AR），氯化钠，无水硫酸钠（AR），用前灼烧干燥，冷却备用。
柠檬酸钠（AR），柠檬酸氢二钠（AR）。
实验用水为优普超纯水机制备的UP水，经水性滤膜过滤。
氨基固相萃取柱：Sepax Technologies 1000mg/6mL。
2.2标准物质、样品
涕灭威、抗蚜威、速灭威、残杀威、异丙威、甲萘威、克百威、灭多威标准品购自德国DR.Ehrenstorfer公司。
分别准确称取适量的各种标准物质，以甲醇配置质量浓度为100mg/L的标准储备液。该溶液于-18℃保存。
苹果样品去土洗净，取样打碎，于-18℃中保存。
2.3 实验方法
2.3.1 SPE固相萃取法
参考GB/T20769-2008《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[2]
SN/T0134-2010《进出口食品中杀线威等12种氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》[3]
前处理：准确称取5g打碎的样品于50ml离心管中，加入20ml乙腈，15000r/min均质提取1min，再于超声波中提取5min，在4000r/min离心5min，取上清液10ml在40℃水浴中旋转浓缩至近干，加入2ml乙腈洗脱，待净化。
净化：在氨基固相萃取柱（1000mg/6ml）中加入约2cm高无水硫酸钠。加样前先用6ml乙腈预洗柱，弃去流出液。当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品浓缩液转移到净化柱上，流速不超过2ml/min，用新浓缩瓶接收。并用2ml乙腈振荡洗脱原浓缩瓶2次，过氨基柱，再用2ml乙腈洗涤氨基柱，至乙腈不再流出。合并上述收集液，于40℃水浴中浓缩至近干。用乙腈甲酸水洗脱定容至1ml，16000r/min离心5min，过0.22μm有机滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
2.3.2 QuEChERS法
参考 NY/T 1380-2007 蔬菜、水果中51種农药多残留的测定 气相色谱-质谱法[4]
SN/T 4138-2015 出口水果和蔬菜中敌敌畏、四氯硝基笨、丙线磷等88种农药残留的筛选检测QuEChERS-气相色谱-负化学源质谱法[5]
准确称取5g打碎的样品于50ml离心管中，加入10ml乙腈，15000r/min均质提取1min，加入4g无水MgSO4和1g无水NaCl，1g柠檬酸钠，0.5g柠檬酸氢二钠[4]，涡旋1分钟，4000r/min离心5min。取上层清液4ml于添加有100mgPSA、400mg无水MgSO4的4ml带盖塑料离心管中，涡旋30秒，16000r/min离心5min，吸取1m清液与1ml 0.1%甲酸水混合成50：50比例定容，过0.22μm有机滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
2.4测定条件
液相色谱条件如下：
色谱柱：ZORBAX C18，150mm×4.6mm，5μm 柱温：40℃
流速：0.6ml/min 进样量：10μL
流动相：0.1%甲酸水：乙腈=90：10 设置时间25min，梯度洗脱。 质谱仪器条件：
模式：ESI（+） 电喷雾电压（IS）：5500V 气帘气压力（CUR）：10psi
雾化气压力（GS1）：60psi 辅助气流速（GS2）：60psi 碰撞气（CAD）：6ml/mim
碰撞池入口电压（EP）：10V 检测方式：多反应监测（MRM） 离子源温度（TEMP）：550℃
所用气体为高纯氮气。
质谱参数见附表1：
分别做：试剂空白试验，样品空白试验，加标回收试验。
线性：选取2～200μg/L的6個线性点，分别为：2，5，10，20，100，200，单位μg/L。
经测试得出各标准曲线为：
甲萘威：y=2.23e+004x+-4.96e+003（r=1.0000）
抗蚜威：y=1.1e+003x+419（r=1.0000）
异丙威：y=3.14e+004x+8.9e+003（r=1.0000）
克百威：y=6.75e+003x+821（r=1.0000）
残杀威：y=4.15e+004x+3.1e+003（r=1.0000）
速灭威：y=2.95e+004 x+2.11e+003（r=1.0000）
速灭威：y=1.68e+004x+1.41e+004（r=0.9999）
灭多威：y=2.62e+004 x+3.7e+004（r=1.0000）
精密度：根据GB/T 27404要求，
经测试，八种氨基甲酸酯类农药RSD分别：甲萘威为1.91%，抗蚜威为1.84%，异丙威RSD为3.18%，克百威为6.50%，残杀威为4.42%，速灭威为1.72%，灭多威为2.64%，涕灭威为2.19%，符合标准≤21%要求。
回收率测试
三.结果与讨论
本实验中SPE固相萃取法是结合GB/T20769-2008以及SN/T 0134-2010两份国标进行的前处理简化操作；QuEChERS法为参考NY/T 1380-2007及SN/T 4138-2015，基本步骤为：①样品粉碎；②溶剂提取分离；③加入MgSO4等盐类除水；④加入PSA等吸附剂除杂中；⑤上清液过滤进行检测。本次实验中则在基本的提取步骤中根据氨基甲酸酯在酸性环境下稳定遇碱分解的特性添加了柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠作为缓冲剂[6]，降低其因碱性易分解的可能性。
从表2及表3两份实验结果可以看出，SPE固相萃取法及QuEChERS法都能满足水果中氨基甲酸酯残留量的检测要求。QuEChERS法在前处理过程中步骤更简便，耗时更短，样品制备过程中与实验人员接触机会少，装置简单，溶剂使用量少，污染小，价格与SPE固相萃取法相比更为低廉。在QuEChERS法上建立水果中8种氨基甲酸酯类农药残留的LC-MS/MS测定方法，更为省时、经济、有效。
参考文献：
[1]刘亚伟，董一威，孙宝利，等。QuEChERS在食品中农药多残留检测的应用研究进展[J]，食品科学，2009，30（09）：285-289。
[2]GB/T20769-2008水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法[S].2009-05-01。
[3]SN/T0134-2010进出口食品中杀线威等12种氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法液相色谱-质谱/质谱法[S].2011-05-01。
[4]NY/T1380-2007蔬菜、水果中51种农药多残留的测定气相色谱-质谱法[S].2007-09-01。
[5]SN/T4138-2015出口水果和蔬菜中敌敌畏、四氯硝基笨、丙线磷等88种农药残留的筛选检测QuEChERS-气相色谱-负化学源质谱法[S].2015-09-01.
[6]达晶，王钢力，曹进，等。QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定植物性食品中30种氨基甲酸酯类农药残留[J]，色谱，2015，33（8）：830-837.
关键词：SPE；QuEChERS；液相色谱-串联质谱；农药残留
一.引言
氨基甲酸酯类农药，无特殊气味，在酸性环境下稳定，遇碱分解，具有选择性强、高效、广谱、对人畜低毒、易分解和残毒少的特点，在农业、林业和牧业等方面得到了广泛的应用。联合国粮食及农业组织及世界卫生组织与联合食品添加剂专家委员会（专家委员会）曾在2005年进行有关氨基甲酸酯类农药评估，认为经食物（不包括酒精饮品）摄入的氨基甲酸酯类农药分量，对健康的影响并不大，但经食物和酒精饮品摄入的氨基甲酸酯类总量，则可能对健康构成潜在的风险。液相色谱-三重四级杆串联质谱灵敏度高，抗干扰能力好，是当前痕量分析比较理想的方法。但食品基质复杂，农药残留量低，干扰因素多，在用有机溶剂提取时，同时会将色素、淀粉等一起提取出来，这些杂质如果不经净化处理，在进入检测器时，严重影响被测物的准确性。因此，样品前处理中目标物的提取、净化的方法选择优化，是农药多残留检测的关键步骤。
目前，已经广泛应该用于实际操作的前处理方法有固相萃取SPE，固相微萃取SPME，凝胶渗透色谱GPC，超临界流体萃取SFE等。2003年，美国农业部Anastassiades教授等开发了一种新的样品前处理技术--QuEChERS方法，是一种用于农产品检测的快速样品前处理技术。其原理与高效液相色谱和固相萃取（SPE）相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。QuEChERS方法不需要经过传统前处理的提取浓缩干燥、过固相柱净化等步骤，实际应用中更为简便。[1]本文选择用苹果作为代表基质，探讨SPE法与QuEChERS方法对水果中氨基甲酸酯类农药的应用适应性。
二.实验部分
2.1仪器与试剂
液相色谱-串联质谱仪：HPLC1200安捷伦液相色谱；API4000Q质谱仪配电喷雾离子源（ESI）；高速分散均质机（德国IKA）；上海亚荣RE3000旋转蒸发仪配套真空循环水泵；涡旋振荡器；湖南赫西离心机；上海安亭高速离心机；智真全自动固相萃取仪。
乙腈（色谱纯），甲酸（HPLC级），PSA 吸附剂；
无水硫酸镁（AR），氯化钠，无水硫酸钠（AR），用前灼烧干燥，冷却备用。
柠檬酸钠（AR），柠檬酸氢二钠（AR）。
实验用水为优普超纯水机制备的UP水，经水性滤膜过滤。
氨基固相萃取柱：Sepax Technologies 1000mg/6mL。
2.2标准物质、样品
涕灭威、抗蚜威、速灭威、残杀威、异丙威、甲萘威、克百威、灭多威标准品购自德国DR.Ehrenstorfer公司。
分别准确称取适量的各种标准物质，以甲醇配置质量浓度为100mg/L的标准储备液。该溶液于-18℃保存。
苹果样品去土洗净，取样打碎，于-18℃中保存。
2.3 实验方法
2.3.1 SPE固相萃取法
参考GB/T20769-2008《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[2]
SN/T0134-2010《进出口食品中杀线威等12种氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》[3]
前处理：准确称取5g打碎的样品于50ml离心管中，加入20ml乙腈，15000r/min均质提取1min，再于超声波中提取5min，在4000r/min离心5min，取上清液10ml在40℃水浴中旋转浓缩至近干，加入2ml乙腈洗脱，待净化。
净化：在氨基固相萃取柱（1000mg/6ml）中加入约2cm高无水硫酸钠。加样前先用6ml乙腈预洗柱，弃去流出液。当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品浓缩液转移到净化柱上，流速不超过2ml/min，用新浓缩瓶接收。并用2ml乙腈振荡洗脱原浓缩瓶2次，过氨基柱，再用2ml乙腈洗涤氨基柱，至乙腈不再流出。合并上述收集液，于40℃水浴中浓缩至近干。用乙腈甲酸水洗脱定容至1ml，16000r/min离心5min，过0.22μm有机滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
2.3.2 QuEChERS法
参考 NY/T 1380-2007 蔬菜、水果中51種农药多残留的测定 气相色谱-质谱法[4]
SN/T 4138-2015 出口水果和蔬菜中敌敌畏、四氯硝基笨、丙线磷等88种农药残留的筛选检测QuEChERS-气相色谱-负化学源质谱法[5]
准确称取5g打碎的样品于50ml离心管中，加入10ml乙腈，15000r/min均质提取1min，加入4g无水MgSO4和1g无水NaCl，1g柠檬酸钠，0.5g柠檬酸氢二钠[4]，涡旋1分钟，4000r/min离心5min。取上层清液4ml于添加有100mgPSA、400mg无水MgSO4的4ml带盖塑料离心管中，涡旋30秒，16000r/min离心5min，吸取1m清液与1ml 0.1%甲酸水混合成50：50比例定容，过0.22μm有机滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
2.4测定条件
液相色谱条件如下：
色谱柱：ZORBAX C18，150mm×4.6mm，5μm 柱温：40℃
流速：0.6ml/min 进样量：10μL
流动相：0.1%甲酸水：乙腈=90：10 设置时间25min，梯度洗脱。 质谱仪器条件：
模式：ESI（+） 电喷雾电压（IS）：5500V 气帘气压力（CUR）：10psi
雾化气压力（GS1）：60psi 辅助气流速（GS2）：60psi 碰撞气（CAD）：6ml/mim
碰撞池入口电压（EP）：10V 检测方式：多反应监测（MRM） 离子源温度（TEMP）：550℃
所用气体为高纯氮气。
质谱参数见附表1：
分别做：试剂空白试验，样品空白试验，加标回收试验。
线性：选取2～200μg/L的6個线性点，分别为：2，5，10，20，100，200，单位μg/L。
经测试得出各标准曲线为：
甲萘威：y=2.23e+004x+-4.96e+003（r=1.0000）
抗蚜威：y=1.1e+003x+419（r=1.0000）
异丙威：y=3.14e+004x+8.9e+003（r=1.0000）
克百威：y=6.75e+003x+821（r=1.0000）
残杀威：y=4.15e+004x+3.1e+003（r=1.0000）
速灭威：y=2.95e+004 x+2.11e+003（r=1.0000）
速灭威：y=1.68e+004x+1.41e+004（r=0.9999）
灭多威：y=2.62e+004 x+3.7e+004（r=1.0000）
精密度：根据GB/T 27404要求，
经测试，八种氨基甲酸酯类农药RSD分别：甲萘威为1.91%，抗蚜威为1.84%，异丙威RSD为3.18%，克百威为6.50%，残杀威为4.42%，速灭威为1.72%，灭多威为2.64%，涕灭威为2.19%，符合标准≤21%要求。
回收率测试
三.结果与讨论
本实验中SPE固相萃取法是结合GB/T20769-2008以及SN/T 0134-2010两份国标进行的前处理简化操作；QuEChERS法为参考NY/T 1380-2007及SN/T 4138-2015，基本步骤为：①样品粉碎；②溶剂提取分离；③加入MgSO4等盐类除水；④加入PSA等吸附剂除杂中；⑤上清液过滤进行检测。本次实验中则在基本的提取步骤中根据氨基甲酸酯在酸性环境下稳定遇碱分解的特性添加了柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠作为缓冲剂[6]，降低其因碱性易分解的可能性。
从表2及表3两份实验结果可以看出，SPE固相萃取法及QuEChERS法都能满足水果中氨基甲酸酯残留量的检测要求。QuEChERS法在前处理过程中步骤更简便，耗时更短，样品制备过程中与实验人员接触机会少，装置简单，溶剂使用量少，污染小，价格与SPE固相萃取法相比更为低廉。在QuEChERS法上建立水果中8种氨基甲酸酯类农药残留的LC-MS/MS测定方法，更为省时、经济、有效。
参考文献：
[1]刘亚伟，董一威，孙宝利，等。QuEChERS在食品中农药多残留检测的应用研究进展[J]，食品科学，2009，30（09）：285-289。
[2]GB/T20769-2008水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法[S].2009-05-01。
[3]SN/T0134-2010进出口食品中杀线威等12种氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法液相色谱-质谱/质谱法[S].2011-05-01。
[4]NY/T1380-2007蔬菜、水果中51种农药多残留的测定气相色谱-质谱法[S].2007-09-01。
[5]SN/T4138-2015出口水果和蔬菜中敌敌畏、四氯硝基笨、丙线磷等88种农药残留的筛选检测QuEChERS-气相色谱-负化学源质谱法[S].2015-09-01.
[6]达晶，王钢力，曹进，等。QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定植物性食品中30种氨基甲酸酯类农药残留[J]，色谱，2015，33（8）：830-837.