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[摘要]目的：探讨皮肤血管瘤和血管畸形的细胞凋亡与增殖的平衡关系及与临床生物学行为的可能关系。方法：采用流式细胞．术检测皮肤血管瘤和血管畸形组织中凋亡细胞比率及细胞周期分布，分析细胞凋亡/增殖水平。结果：血管瘤增生期和消退期凋亡/增殖水平出现下调和上调(P＜0.05)，而血管畸形细胞凋亡/增殖水平与正常皮肤相比无显著性差异(P＞0.05)。结论：细胞凋亡/增殖水平在皮肤血管瘤和血管畸形之间存在差异且可能与二者的病理演变过程密切相关。
[关键词]血管瘤；血管畸形；增殖；凋亡
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)06－0743－03
自1982年Mulliken和Glowaki将传统意义上的血管瘤分为(真性)血管瘤和血管畸形以来，有关此类疾病的分类方法和相关研究得到了不断的完善和发展，对于血管瘤和血管畸形在组织学、临床生物学行为和诊断治疗方面的对比研究颇多，二者明显不同的病程演变和临床生物学特征也逐渐被认识，但其发生机制尚不明确。本实验通过对不同时期血管瘤、血管畸形和正常皮肤的细胞增殖和凋亡水平进行对比分析，旨在初步探讨两种病变的凋亡与增殖平衡的变化规律及其与临床生物学行为的关系。
1 材料和方法
1．1 材料：选用2005年2月～2006年1月临床诊断为血管瘤和血管畸形的手术切除的新鲜标本56例，部位为颌面部、四肢及躯干部。标本均分为两份，一部分冻存备用(为尽量减少冻存对细胞存活率的影响，采用慢速分步降温，先于4℃冷平衡15min，然后-20℃ 30 min，最后置入-80℃冰箱保存)，一部分经10％甲醛固定后行常规石蜡包埋，制4μm厚连续切片，HE染色后光镜下根据Mulliken等的组织学标准并结合疾病的临床生物学行为将病变分类：血管瘤40例，年龄12天～38岁，其中增生期(或叫增殖期20例，消退期(或叫退化期)20例；血管畸形13例，年龄2月～60岁；另有3例病理证实非血管瘤和血管畸形。所有标本术前未行干预性治疗，术后病理确诊，无合并结缔组织疾病、免疫系统疾病及其他重要脏器疾病。同时取20例正常全厚皮肤作为对照。
1．2 方法：应用流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡和细胞周期分布。
1．2．1 单细胞悬液的制备：组织块解冻后置于70％冷乙醇溶液4℃固定24h。将组织块置于120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，以眼科镊子轻搓组织，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。将平皿中的混悬液以300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，以800r/min离心2min。去除上清液，加入PBS液调整单细胞悬液为1×106/ml。
1．2．2 细胞凋亡和细胞周期测定：取单细胞悬液100μl，加入碘化丙啶(PI)1ml 4℃避光染色30min，以500目铜网过滤即可上机检测。
1．2．3 流式细胞仪检测条件及参数：采用美国Beckman Coulter公司的Epics－XL Ⅱ型流式细胞仪，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析，应用Multicycle AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。检测前调整仪器CV值在2％以内。
1．2．4 结果判定：应用DNA细胞周期分析软件，获取DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数(proliferation index，PI)表示细胞增殖活性，PI=(S＋G2/M)/(G0//G1+S+G2/M)×100％。在DNA直方图上于正常二倍体细胞的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰(sub－G1)，其占分析细胞的百分比经分析软件处理后得出细胞凋亡率(apoptosis rates，AR)。
1．3统计学处理：所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计分析。样本均数比较采用方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2．1 HE染色结果：光镜下增生期血管瘤内皮细胞大量增生呈团索状，内皮细胞核肥大而淡染，血管腔呈窦隙样或无明显血管腔；消退期血管瘤内皮细胞数目减少，内皮细胞核扁平，血管腔明显，血管周围纤维结缔组织增多。血管畸形血管管腔呈异常扩张，管壁由扁平的内皮细胞构成，胞核扁平，无内皮细胞增多；正常皮肤中的毛细血管由1～2个内皮细胞围成，管壁较薄，内皮细胞胞质薄：仅含核的部分略厚，内皮细胞核扁平。
2．2 细胞凋亡率、增殖指数结果：血管瘤各组AR，PI及AR/PI与血管畸形和正常皮肤之间差异均有统计学意义，而血管畸形和正常皮肤之间均无明显差异(P＞0.05)。见表1。
3 讨论
传统上血管瘤一词用于定义多种脉管性病变，并根据形态学分类分为毛细血管瘤(包括葡萄酒色斑与草莓状血管瘤)、海绵状血管瘤、蔓状血管瘤和混合型血管瘤，这种分类方法仅仅根据临床症状和形态结构进行，并不能确切地反映各类疾病的本质。1982年Mulliken和Glowaki根据血管内皮细胞的组织病理学特点，结合疾病的临床行为及其他实验室指标，将传统意义上所谓的血管瘤分为(真性)血管瘤和血管畸形两种，并进一步将血管瘤分为增生期和消退期两期。这种生物学分类方法较为合理科学，对脉管性病变的诊断、鉴别诊断、治疗方法的选择及预后判断都有更为实际的指导意义。1993年Jackson等根据血管造影、多普勒超声、核磁共振等检查结果所提示的血流动力学特点将血管畸形进一步分为高流量和低流量两型。1995年Waner和Suen根据脉管畸形形成的机制及病变发生的部位等，对Mulliken等的分类提出了修改和补充，以微静脉畸形取代了原分类中的毛细血管畸形，此分类方法得到国外同行广泛认同，我国学者亦推荐采用。对于脉管性疾病的准确分类将利于对其相关领域的深入研究。
血管瘤是以内皮细胞异常增殖为特征的肿瘤，而血管畸形其血管内皮细胞分裂率正常，无异常增殖状态，是血管形态结构上的异常。二者的临床生物学特征和预后有明显不同，血管瘤的自然病程较为特殊，它们往往于出生后1个月内出现，在前6～12个月内迅速生长，且可超出小儿正常发育速度：在随后的1～5年(或更长时间)肿物增生速度逐渐减慢或停止生长，大部分血管瘤有自行缓慢消退的趋势。而血管畸形通常在出生时即存在，它的增长速度和生长发育成比例，可长期稳定存在，无自行消退倾向。此外二者在临床表现、影像学检查、血液动力学改变、部分细胞和细胞外标记物方面也有所不同。至今血管瘤和血管畸形这两种病变的发生、发展机制尚不明确。近年来随着对肿瘤发生 发展机制的研究，发现许多肿瘤细胞数目的控制是通过细胞增殖和凋亡的平衡来实现的，但有关血管瘤和血管畸形组织中的细胞增殖和凋亡的对比研究尚不多见。
本实验对血管瘤和血管畸形组织进行细胞周期分析，检测了病变细胞周期时相S期的比率，直接反映了细胞增殖能力，结果显示血管瘤组织中具有较高的PI，且在增生期较消退期更为明显。而血管畸形组织与正常皮肤的PI相近，无显著性差异，提示血管瘤中的细胞具有较强的增殖分裂能力，尤其是增生期的血管瘤细胞的增殖能力相对更强；而血管畸形与正常皮肤相似，细胞具有正常的增殖周期，无异常的高增殖状态，与MullikenTan等对血管瘤及血管畸形内皮细胞体外培养的生长特性的研究结果相符，依此也可以解释二者不同的组织学改变。本实验同时应用FCM检测了凋亡细胞比率，当细胞凋亡时可发生形态学和生化方面特征性的改变，可用多种方法进行检测，各有优缺点。FCM检测凋亡直观、简便和迅速，是目前公认的凋亡量化指标，与其它凋亡分析方法具有良好的相关性，但不足是特异性稍差。本组结果显示血管瘤各期AR均高于血管畸形和正常皮肤，其中在消退期尤为明显，血管畸形组织的细胞凋亡水平与正常皮肤相比无显著性差别，表明在血管瘤由增生期向消退期发展的病程中存在着逐渐活跃的细胞凋亡现象。
机体的细胞数目控制是通过细胞增殖和细胞死亡的平衡来实现的。结合本实验细胞增殖与凋亡结果，提示在血管畸形组织中，细胞的凋亡/增殖水平与正常皮肤相似，未出现平衡性的改变，在组织学形态学上也仅仅显示出血管结构的改变，而未出现细胞数目的明显改变和新生血管形成，不存在细胞异常增殖现象，且内皮细胞的形态与正常血管内皮细胞一致。临床上血管畸形的生长过程平稳，生长速度与小儿生长发育成比例增长，它的渐进性增大不是由于病变内的细胞增生或血管、淋巴管数量的增多所致，而是因为病变内原有血管或淋巴管管腔进行性扩张而引起。血管畸形与血管瘤不同，无明显的增生期和消退期，也无自行消退的趋势，所以一般需积极治疗。而对于血管瘤，在增生期细胞增殖活性大于凋亡活性，AR/PI水平下调，细胞不断增殖，在组织学形态上表现为血管瘤内皮细胞大量增生；而在消退期较增生期相比，凋亡水平明显升高，增殖活性下降，AR/PI平衡出现明显上调，表明此期细胞凋亡的增加和细胞增殖的相对抑制促使细胞从增殖走向凋亡，在组织学形态上显示其内皮细胞由异常增生到逐渐减少，这也与它的临床生物学行为相符，即存在可超出小儿正常发育速度的快速生长期，此后往往生长速度逐渐减慢且存在自行消退的可能，所以对于大部分血管瘤可先进行严密动态观察。可以推测细胞凋亡/增殖的平衡改变可能与血管瘤的增生消退过程密切相关，细胞凋亡与增殖的平衡状态可能是血管瘤可自行消退而血管畸形不能白行消退的重要因素之一。
血管瘤和血管畸形是两类性质不同的病变，其发生发展的病理过程亦不同，确切机制尚不明确，本实验结果提示在血管瘤的自然病程中存在着凋亡/增殖平衡的上调，这可能与它的白行消退有关，进一步研究凋亡/增殖平衡关系及其调控机制，将有利于发现更有效的手段来调控治疗血管瘤。
[关键词]血管瘤；血管畸形；增殖；凋亡
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)06－0743－03
自1982年Mulliken和Glowaki将传统意义上的血管瘤分为(真性)血管瘤和血管畸形以来，有关此类疾病的分类方法和相关研究得到了不断的完善和发展，对于血管瘤和血管畸形在组织学、临床生物学行为和诊断治疗方面的对比研究颇多，二者明显不同的病程演变和临床生物学特征也逐渐被认识，但其发生机制尚不明确。本实验通过对不同时期血管瘤、血管畸形和正常皮肤的细胞增殖和凋亡水平进行对比分析，旨在初步探讨两种病变的凋亡与增殖平衡的变化规律及其与临床生物学行为的关系。
1 材料和方法
1．1 材料：选用2005年2月～2006年1月临床诊断为血管瘤和血管畸形的手术切除的新鲜标本56例，部位为颌面部、四肢及躯干部。标本均分为两份，一部分冻存备用(为尽量减少冻存对细胞存活率的影响，采用慢速分步降温，先于4℃冷平衡15min，然后-20℃ 30 min，最后置入-80℃冰箱保存)，一部分经10％甲醛固定后行常规石蜡包埋，制4μm厚连续切片，HE染色后光镜下根据Mulliken等的组织学标准并结合疾病的临床生物学行为将病变分类：血管瘤40例，年龄12天～38岁，其中增生期(或叫增殖期20例，消退期(或叫退化期)20例；血管畸形13例，年龄2月～60岁；另有3例病理证实非血管瘤和血管畸形。所有标本术前未行干预性治疗，术后病理确诊，无合并结缔组织疾病、免疫系统疾病及其他重要脏器疾病。同时取20例正常全厚皮肤作为对照。
1．2 方法：应用流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡和细胞周期分布。
1．2．1 单细胞悬液的制备：组织块解冻后置于70％冷乙醇溶液4℃固定24h。将组织块置于120目不锈钢网上，下置一平皿，用眼科剪刀将组织剪碎，以眼科镊子轻搓组织，边搓边用生理盐水冲洗，直至将组织搓完为止。将平皿中的混悬液以300目铜网过滤去除细胞团块，收集细胞悬液，以800r/min离心2min。去除上清液，加入PBS液调整单细胞悬液为1×106/ml。
1．2．2 细胞凋亡和细胞周期测定：取单细胞悬液100μl，加入碘化丙啶(PI)1ml 4℃避光染色30min，以500目铜网过滤即可上机检测。
1．2．3 流式细胞仪检测条件及参数：采用美国Beckman Coulter公司的Epics－XL Ⅱ型流式细胞仪，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析，应用Multicycle AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。检测前调整仪器CV值在2％以内。
1．2．4 结果判定：应用DNA细胞周期分析软件，获取DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数(proliferation index，PI)表示细胞增殖活性，PI=(S＋G2/M)/(G0//G1+S+G2/M)×100％。在DNA直方图上于正常二倍体细胞的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰(sub－G1)，其占分析细胞的百分比经分析软件处理后得出细胞凋亡率(apoptosis rates，AR)。
1．3统计学处理：所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计分析。样本均数比较采用方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2．1 HE染色结果：光镜下增生期血管瘤内皮细胞大量增生呈团索状，内皮细胞核肥大而淡染，血管腔呈窦隙样或无明显血管腔；消退期血管瘤内皮细胞数目减少，内皮细胞核扁平，血管腔明显，血管周围纤维结缔组织增多。血管畸形血管管腔呈异常扩张，管壁由扁平的内皮细胞构成，胞核扁平，无内皮细胞增多；正常皮肤中的毛细血管由1～2个内皮细胞围成，管壁较薄，内皮细胞胞质薄：仅含核的部分略厚，内皮细胞核扁平。
2．2 细胞凋亡率、增殖指数结果：血管瘤各组AR，PI及AR/PI与血管畸形和正常皮肤之间差异均有统计学意义，而血管畸形和正常皮肤之间均无明显差异(P＞0.05)。见表1。
3 讨论
传统上血管瘤一词用于定义多种脉管性病变，并根据形态学分类分为毛细血管瘤(包括葡萄酒色斑与草莓状血管瘤)、海绵状血管瘤、蔓状血管瘤和混合型血管瘤，这种分类方法仅仅根据临床症状和形态结构进行，并不能确切地反映各类疾病的本质。1982年Mulliken和Glowaki根据血管内皮细胞的组织病理学特点，结合疾病的临床行为及其他实验室指标，将传统意义上所谓的血管瘤分为(真性)血管瘤和血管畸形两种，并进一步将血管瘤分为增生期和消退期两期。这种生物学分类方法较为合理科学，对脉管性病变的诊断、鉴别诊断、治疗方法的选择及预后判断都有更为实际的指导意义。1993年Jackson等根据血管造影、多普勒超声、核磁共振等检查结果所提示的血流动力学特点将血管畸形进一步分为高流量和低流量两型。1995年Waner和Suen根据脉管畸形形成的机制及病变发生的部位等，对Mulliken等的分类提出了修改和补充，以微静脉畸形取代了原分类中的毛细血管畸形，此分类方法得到国外同行广泛认同，我国学者亦推荐采用。对于脉管性疾病的准确分类将利于对其相关领域的深入研究。
血管瘤是以内皮细胞异常增殖为特征的肿瘤，而血管畸形其血管内皮细胞分裂率正常，无异常增殖状态，是血管形态结构上的异常。二者的临床生物学特征和预后有明显不同，血管瘤的自然病程较为特殊，它们往往于出生后1个月内出现，在前6～12个月内迅速生长，且可超出小儿正常发育速度：在随后的1～5年(或更长时间)肿物增生速度逐渐减慢或停止生长，大部分血管瘤有自行缓慢消退的趋势。而血管畸形通常在出生时即存在，它的增长速度和生长发育成比例，可长期稳定存在，无自行消退倾向。此外二者在临床表现、影像学检查、血液动力学改变、部分细胞和细胞外标记物方面也有所不同。至今血管瘤和血管畸形这两种病变的发生、发展机制尚不明确。近年来随着对肿瘤发生 发展机制的研究，发现许多肿瘤细胞数目的控制是通过细胞增殖和凋亡的平衡来实现的，但有关血管瘤和血管畸形组织中的细胞增殖和凋亡的对比研究尚不多见。
本实验对血管瘤和血管畸形组织进行细胞周期分析，检测了病变细胞周期时相S期的比率，直接反映了细胞增殖能力，结果显示血管瘤组织中具有较高的PI，且在增生期较消退期更为明显。而血管畸形组织与正常皮肤的PI相近，无显著性差异，提示血管瘤中的细胞具有较强的增殖分裂能力，尤其是增生期的血管瘤细胞的增殖能力相对更强；而血管畸形与正常皮肤相似，细胞具有正常的增殖周期，无异常的高增殖状态，与MullikenTan等对血管瘤及血管畸形内皮细胞体外培养的生长特性的研究结果相符，依此也可以解释二者不同的组织学改变。本实验同时应用FCM检测了凋亡细胞比率，当细胞凋亡时可发生形态学和生化方面特征性的改变，可用多种方法进行检测，各有优缺点。FCM检测凋亡直观、简便和迅速，是目前公认的凋亡量化指标，与其它凋亡分析方法具有良好的相关性，但不足是特异性稍差。本组结果显示血管瘤各期AR均高于血管畸形和正常皮肤，其中在消退期尤为明显，血管畸形组织的细胞凋亡水平与正常皮肤相比无显著性差别，表明在血管瘤由增生期向消退期发展的病程中存在着逐渐活跃的细胞凋亡现象。
机体的细胞数目控制是通过细胞增殖和细胞死亡的平衡来实现的。结合本实验细胞增殖与凋亡结果，提示在血管畸形组织中，细胞的凋亡/增殖水平与正常皮肤相似，未出现平衡性的改变，在组织学形态学上也仅仅显示出血管结构的改变，而未出现细胞数目的明显改变和新生血管形成，不存在细胞异常增殖现象，且内皮细胞的形态与正常血管内皮细胞一致。临床上血管畸形的生长过程平稳，生长速度与小儿生长发育成比例增长，它的渐进性增大不是由于病变内的细胞增生或血管、淋巴管数量的增多所致，而是因为病变内原有血管或淋巴管管腔进行性扩张而引起。血管畸形与血管瘤不同，无明显的增生期和消退期，也无自行消退的趋势，所以一般需积极治疗。而对于血管瘤，在增生期细胞增殖活性大于凋亡活性，AR/PI水平下调，细胞不断增殖，在组织学形态上表现为血管瘤内皮细胞大量增生；而在消退期较增生期相比，凋亡水平明显升高，增殖活性下降，AR/PI平衡出现明显上调，表明此期细胞凋亡的增加和细胞增殖的相对抑制促使细胞从增殖走向凋亡，在组织学形态上显示其内皮细胞由异常增生到逐渐减少，这也与它的临床生物学行为相符，即存在可超出小儿正常发育速度的快速生长期，此后往往生长速度逐渐减慢且存在自行消退的可能，所以对于大部分血管瘤可先进行严密动态观察。可以推测细胞凋亡/增殖的平衡改变可能与血管瘤的增生消退过程密切相关，细胞凋亡与增殖的平衡状态可能是血管瘤可自行消退而血管畸形不能白行消退的重要因素之一。
血管瘤和血管畸形是两类性质不同的病变，其发生发展的病理过程亦不同，确切机制尚不明确，本实验结果提示在血管瘤的自然病程中存在着凋亡/增殖平衡的上调，这可能与它的白行消退有关，进一步研究凋亡/增殖平衡关系及其调控机制，将有利于发现更有效的手段来调控治疗血管瘤。