目的设计柯萨奇病毒A6特异性TaqMan探针和引物,建立敏感、特异的实时荧光逆转录PCR检测方法。方法针对CVA6VP1基因,设计荧光探针和引物,优化摩尔配比,建立并优化PCR反应体系。回收PCR产物,构建重组质粒,经梯度稀释后作为模板进行敏感性试验,绘制标准曲线,评估检测方法的敏感性。对包括多种肠道病毒在内的共15种病毒进行特异性实验,评估检测方法特异性。对479份手足口病患者临床标本进行鉴定,检出的CVA6阳性标本再用普通PCR方法复核。随机抽取10份实时荧光PCR阳性产物克隆后测序,评估本方法检测临床标本的准确性。结果建立的实时荧光逆转录检测方法扩增出CVA6VP1基因的目的序列,当探针、引物摩尔配比在1︰2~1︰5时,PCR结果均较为理想,探针、引物摩尔配比为1︰3.5时,荧光强度最大。敏感性试验显示该方法扩增效率为88.9%,可检出低至2.1×102copies/ml核酸模板。特异性试验显示该方法仅能对CVA6实现特异性扩增,其他多种病毒反应均为阴性。从479份手足口临床标本中共检出CVA6阳性标本84份,与普通PCR方法复核结果一致。随机抽取的10份阳性产物克隆测序鉴定后均为CVA6目的序列。结论建立的实时荧光逆转录PCR方法具有特异性强、灵敏度高、准确可靠等优点,可用于CVA6型手足口病检测。