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摘要：目的：通过转染Sox9基因促进细胞外基质合成代谢，通过烟酰胺抑制细胞外基质分解代谢，以期在体外影响髓核细胞外基质代谢。方法： A组：转染SOX9+0.5mg/ml烟酰胺，B组：单纯转染SOX9，C组：单纯加入0.5mg/ml烟酰胺，D组：对照组，不加干扰因素。各组细胞均在海藻酸钠三维立体培养体系中培养，分别在7、14、21天三个时间点进行Ⅱ型胶原、糖胺多糖检测。结果：转染SOX9+0.5mg/ml烟酰胺组对提高髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖表达影响显著。结论：转染SOX9与烟酰胺具有协同作用，可以有效提高髓核细胞功能。
关键词：SOX9， 烟酰胺， 髓核细胞
2013年广州市医药卫生科技项目：20131A011036
椎间盘退行性变主要是机械、营养、生物等各种因素造成损伤，导致椎间盘炎症介质增多、基质金属蛋白酶和其他蛋白水解酶含量及活性增加，引起细胞外基质降解，髓核细胞数目减少，进而使蛋白多糖、胶原的合成减少，椎间盘类软骨细胞赖以生存的内环境被破坏，不能维持椎间盘内应有的张力，从而导致椎间盘的退行性变。加之椎间盘是一封闭结构，营养供应差，退行性变很难自行修复[1]。
我们通过转染Sox9基因促进细胞外基质合成代谢，通过烟酰胺抑制细胞外基质分解代谢，以期在体外影响髓核细胞外基质代谢，促进髓核细胞功能正常化。
1.材料与方法
1.1质粒构建与引物设计
采用基因工程方法设计引物，双酶切后经过电泳、回收、DNA片段连接等得到荧光显微镜下分析报告基因绿色荧光蛋白转染效率载体，通过转染感受态宿主菌、提取质粒、用脂质体技术将pGFP-IRES2-Sox9质粒转染G418细胞，筛选Sox9的抗性克隆，转染第一代退变髓核细胞，并通过Western-blot、RT-PCR、荧光显微镜等检测转染髓核细胞的pGFP-IRES2-Sox9表达。
1.2 体外退变椎间盘髓核细胞实验
随机将退变椎间盘髓核细胞分为四组，A组：转染SOX9+0.5mg/ml烟酰胺，B组：单纯转染SOX9，C组：单纯加入0.5mg/ml烟酰胺，D组：对照组，不加干扰因素。
各组细胞均在海藻酸钠三维立体培养体系中培养，分别在7、14、21天三个时间点进行Ⅱ型胶原、糖胺多糖检测。
3. 讨论
Paul[2]等将Sox9基因转染体外培养的退变人髓核细胞，结果不但Sox9翻译因子的表达明显增加，Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达也得到了显著高；Gruber[3]等对不同退变程度的人椎间盘进行了Sox9翻译因子的免疫定位研究，发现随着退变程度的加重，Sox9翻译因子的表达也逐渐降低。进一步研究发现， 大多数生长刺激因子都是通过提高Sox9基因mRNA的表达，从而引起Col2al表达的增加，相应地增加II型胶原及蛋白聚糖的合成。
烟酰胺拮抗TNF-α、IL-1β等主要炎症因子逆转退变：烟酰胺作为具有抗炎和促进能量代谢作用的维生素，可以通过抑制iNOS表达和维持TGF-β1 的表达来抑制TNF-α、IL-1β诱导的椎间盘组织基质破坏。Duan等[4]研究发现，经烟酰胺保护的椎间盘细胞iNOS阳性率大大降低。徐蔚蔚等[5]研究表明烟酰胺可以抑制IL-1β诱导的椎间盘细胞凋亡，改善IL-1β导致的椎间盘能量代谢障碍。
本项目检测SOX9基因协同烟酰胺作用于人髓核细胞，利用其转录因子SOX9对细胞外基质的调节作用及烟酰胺对炎症因子的拮抗作用，达到抑制椎间盘细胞外基质的降解，促进了细胞外基质的合成代谢的作用，为治疗逆转椎间盘细胞退行性变化提供新的治疗方法。
参考文献：
1. Maniadakis N，Gray A.The economic burden of back pain in the UK.Pain.2000；84（1）：95-103.
2. Paul R，Haydon R C，Cheng H W，et al.Potential use of Sox9 gene therapy for intervertebral degenerative disc disease.Spine，2003，28（8）：755-763.
3. Gruber HE， Norton HJ， Ingram JA， et al. The Sox9 transcription factor in the human disc： decreased immunolocalization with age and disc degeneration .Spine， 2005，30（6）：625-630.
4. Duan D，Yang S，Shao Z.etal.Protectiv effect of niacinamide on interleukin-1beta induced annulus fibrosus typeⅡ collagen degeneration in vitro.J Huazhong Univ Sci Techno Med Sci，2007，27（1）：68-71
5. 徐蔚蔚，邵增务，熊蠡茗等，烟酰胺对体外培养兔椎间盘细胞凋亡及能量代谢相关基因表达的影响. 华中科技大学学报，2008，38（2）：141-145.
关键词：SOX9， 烟酰胺， 髓核细胞
2013年广州市医药卫生科技项目：20131A011036
椎间盘退行性变主要是机械、营养、生物等各种因素造成损伤，导致椎间盘炎症介质增多、基质金属蛋白酶和其他蛋白水解酶含量及活性增加，引起细胞外基质降解，髓核细胞数目减少，进而使蛋白多糖、胶原的合成减少，椎间盘类软骨细胞赖以生存的内环境被破坏，不能维持椎间盘内应有的张力，从而导致椎间盘的退行性变。加之椎间盘是一封闭结构，营养供应差，退行性变很难自行修复[1]。
我们通过转染Sox9基因促进细胞外基质合成代谢，通过烟酰胺抑制细胞外基质分解代谢，以期在体外影响髓核细胞外基质代谢，促进髓核细胞功能正常化。
1.材料与方法
1.1质粒构建与引物设计
采用基因工程方法设计引物，双酶切后经过电泳、回收、DNA片段连接等得到荧光显微镜下分析报告基因绿色荧光蛋白转染效率载体，通过转染感受态宿主菌、提取质粒、用脂质体技术将pGFP-IRES2-Sox9质粒转染G418细胞，筛选Sox9的抗性克隆，转染第一代退变髓核细胞，并通过Western-blot、RT-PCR、荧光显微镜等检测转染髓核细胞的pGFP-IRES2-Sox9表达。
1.2 体外退变椎间盘髓核细胞实验
随机将退变椎间盘髓核细胞分为四组，A组：转染SOX9+0.5mg/ml烟酰胺，B组：单纯转染SOX9，C组：单纯加入0.5mg/ml烟酰胺，D组：对照组，不加干扰因素。
各组细胞均在海藻酸钠三维立体培养体系中培养，分别在7、14、21天三个时间点进行Ⅱ型胶原、糖胺多糖检测。
3. 讨论
Paul[2]等将Sox9基因转染体外培养的退变人髓核细胞，结果不但Sox9翻译因子的表达明显增加，Ⅱ型胶原及蛋白多糖的表达也得到了显著高；Gruber[3]等对不同退变程度的人椎间盘进行了Sox9翻译因子的免疫定位研究，发现随着退变程度的加重，Sox9翻译因子的表达也逐渐降低。进一步研究发现， 大多数生长刺激因子都是通过提高Sox9基因mRNA的表达，从而引起Col2al表达的增加，相应地增加II型胶原及蛋白聚糖的合成。
烟酰胺拮抗TNF-α、IL-1β等主要炎症因子逆转退变：烟酰胺作为具有抗炎和促进能量代谢作用的维生素，可以通过抑制iNOS表达和维持TGF-β1 的表达来抑制TNF-α、IL-1β诱导的椎间盘组织基质破坏。Duan等[4]研究发现，经烟酰胺保护的椎间盘细胞iNOS阳性率大大降低。徐蔚蔚等[5]研究表明烟酰胺可以抑制IL-1β诱导的椎间盘细胞凋亡，改善IL-1β导致的椎间盘能量代谢障碍。
本项目检测SOX9基因协同烟酰胺作用于人髓核细胞，利用其转录因子SOX9对细胞外基质的调节作用及烟酰胺对炎症因子的拮抗作用，达到抑制椎间盘细胞外基质的降解，促进了细胞外基质的合成代谢的作用，为治疗逆转椎间盘细胞退行性变化提供新的治疗方法。
参考文献：
1. Maniadakis N，Gray A.The economic burden of back pain in the UK.Pain.2000；84（1）：95-103.
2. Paul R，Haydon R C，Cheng H W，et al.Potential use of Sox9 gene therapy for intervertebral degenerative disc disease.Spine，2003，28（8）：755-763.
3. Gruber HE， Norton HJ， Ingram JA， et al. The Sox9 transcription factor in the human disc： decreased immunolocalization with age and disc degeneration .Spine， 2005，30（6）：625-630.
4. Duan D，Yang S，Shao Z.etal.Protectiv effect of niacinamide on interleukin-1beta induced annulus fibrosus typeⅡ collagen degeneration in vitro.J Huazhong Univ Sci Techno Med Sci，2007，27（1）：68-71
5. 徐蔚蔚，邵增务，熊蠡茗等，烟酰胺对体外培养兔椎间盘细胞凋亡及能量代谢相关基因表达的影响. 华中科技大学学报，2008，38（2）：141-145.