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[摘 要][目的]从小鼠组织细胞中提取的a基因片段的克隆；[方法]从小鼠组织细胞中提取目的基因片段，采用PCR方法将该目的基因片段扩增，将其与表达载体相连接，构建重组质粒[1]；将该重组质粒转入大肠杆菌Top10内，用蓝白斑筛选法筛选菌株进行电泳等检验。[结果]含目的基因质粒转化效率很高，电泳结果知a基因克隆成功，形成大量可用重组质粒方便下一步进行研究。[结论]从小鼠组织细胞中提取的a基因克隆效率高，菌落PCR与菌液PCR结果相近，对实验结果无明显影响。
[关键词]目的基因；基因重组；PCR；蓝白斑筛选
中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）06-0131-01
PCR技术通过对温度的控制能够成功快速扩增目的基因以进行下一步实验，在基因重组实验中被广泛使用；核酸限制性内切酶酶切所得的末端有粘性末端与平末端两种，其中Tap酶酶切所得为粘性末端，粘性末端连接效率大于平末端；本次实验通过菌落PCR、菌液PCR扩增目的基因后观察电泳条带确定克隆结果。
1 材料与方法
1.1 材料
Top10大肠杆菌、Taq内切酶、小鼠组织细胞中提取的a基因
1.2 试剂
LB培养液、氨苄青霉素、6×buffer、上游引物、下游引物、ddH2O
2 实验过程
1.目的基因PCR扩增
使用Taq酶作为聚合酶进行PCR
2.扩增产物的纯化
3.目的基因与plBuscript连接
共分为三组，分别为：①实验组：Inser DNA片段的连接：PCR目的基因之后测得Inser DNA的浓度为37.7ng/ul，则Insert DNA使用量为0.7ul。②阳性对照：Control DNA片段的连接
③阴性对照：
4.大肠杆菌感受态细胞的制备
5.重组质粒转入感受态细胞
6.涂布37℃倒置培养，并进行蓝白斑筛选
由于第一第二实验组培养12小时的菌落大小不足以进行菌落PCR，故将这两组的培养时间延长至20小时
7.第一实验组进行菌落PCR、电泳。
8.第二实验组进行挑菌、摇菌
9.第二实验组进行菌液PCR、电泳
10.将电泳所得结果拍照、分析
3 结果与分析
本实验通过对目的基因进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳估测目的基因浓度大小、纯化目的基因、紫外分光光度计检测目的基因浓度、将目的基因与载体连接形成重组质粒、将重组质粒转化进大肠杆菌TOP10感受态细胞、进行蓝白斑筛选，这些步骤可以筛选出含有重组质粒的菌落，但由于可能出现假阳性，为确定菌中确实含有重组质粒，通过两种方式检测，一种为菌落PCR及电泳，一种为菌液PCR及电泳。
（1）由利用Tap酶进行目的基因PCR扩增后的电泳结果可看出，所提供的目的基因大小为200bp左右，整个凝胶板上的电泳条带都普遍模糊，可能是因为上样时时间间隔太长导致样品在电泳槽中扩散。为了保证后续实验进行，对于聚合酶的产物选择两个电泳条带最亮的进行后续实验。。
（2）对PCR产物进行纯化后，紫外分光光度计进行定量，测得以Tap酶为聚合酶的，DNA浓度为31.1ng/ul。重组质粒时，要求载体与目的基因质量比=1：1～1：5，或者物质的量比=1：1～1：5。根据计算，该 DNA浓度可进行重组质粒。
（3）由培养皿上菌落生长情况可知道，实验组出现了较多的白色菌落，且没有蓝色菌落；阳性对照组出现很多白色菌落，没有蓝色菌落；阴性对照组出现了少量的白色菌落，没有蓝色菌落。其中实验组和阳性对照组符合预先设想，出现白色菌落说明重组质粒转化进菌中，且转化效率较高；没有蓝色菌落出现说明重组质粒时反应时间够长，且载体与目的基因所用比例恰当，目的基因与载体连接很成功；长出来的菌落较密，说明感受态细胞制备结果较好，且制备完后马上进行转化，效果较好；阳性对照组中菌落更为密集，符合预期，效果更好。而阴性对照组本不应出现菌落，却出现了少量菌落，可能是由于在涂板时灭菌不够彻底，或无菌操作时操作失误。
（4）由菌落PCR、电泳之后的结果可看出，出现的条带显示为200bp左右，与原先提供的目的基因PCR电泳结果相同，说明这些菌落的菌中都转入了重组质粒，但部分条带很淡，有可能是因为挑菌出来进行PCR时，挑得太少，扩增之后DNA浓度较低；有些样品看不到条带，说明菌落为假阳性。因此，如果要保存转入了重组质粒的菌，以便以后可以使用，可选择有出现适当条带的菌落，进一步培养、保存。
（5）由菌液PCR、电泳之后的结果可看出，出现的条带显示为200bp左右，与原先提供的目的基因PCR电泳结果相同，说明这些菌液的菌中转入了重组质粒。而本小组分别使用锥形瓶和EP管作为培养菌液容器，空间大小不同，但最后菌液PCR后电泳出来的条带明暗相差不大，因此，在锥形瓶有限的情况下，可以用EP管作为容器进行培养。若培养时间有差，最后菌液PCR后电泳出来的条带有所差异，摇菌培养24小时后菌液PCR后电泳出来的条带较淡，可能是由于时间过长，氨苄青霉素作用变弱，逐渐有其他的菌出现，抢占大肠杆菌TOP10的资源，因此，摇菌培养时间最好不要超过24小时。菌落PCR后保存于4℃下24h的样品，电泳出来的条带与之前菌落PCR后马上电泳的相差不大，因此当有特殊情况无法及时电泳时，将样品存放于4℃下短暂保存，对实验结果影响不大。当然，在本次实验中，样本数少，可能还不具代表性，可以再进一步实验，进行研究探讨。
4 结论与讨论
由本次实验结果可得出，本次对小鼠组织、细胞中提取出的a基因进行克隆的实验实验结果较成功，使用Taq酶能对目的基因进行PCR；在涂布、摇菌等过程中要注意杂菌干扰，防止对实验结果造成影响；由蓝白斑筛选结果可知本次实验中目的基因与载体连接效率很高，但由电泳结果可知某些白色单菌落呈现假阳性；本次实验还证明菌落PCR、与菌液PCR都能成功扩增已转化成功目的基因，且菌液样品放于4℃下短暂保存，对实验结果影响不大。但本次实验中样本数少，仍不具代表性，可以再进一步实验，进行研究探讨
参考文献
[1] 黛艳梅，温博海，邱玲，等.立式立克次体外膜蛋白B基因片段的克隆与表达[J].《中国人兽共患病杂志》，2004，20（10）：839-842.
[关键词]目的基因；基因重组；PCR；蓝白斑筛选
中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）06-0131-01
PCR技术通过对温度的控制能够成功快速扩增目的基因以进行下一步实验，在基因重组实验中被广泛使用；核酸限制性内切酶酶切所得的末端有粘性末端与平末端两种，其中Tap酶酶切所得为粘性末端，粘性末端连接效率大于平末端；本次实验通过菌落PCR、菌液PCR扩增目的基因后观察电泳条带确定克隆结果。
1 材料与方法
1.1 材料
Top10大肠杆菌、Taq内切酶、小鼠组织细胞中提取的a基因
1.2 试剂
LB培养液、氨苄青霉素、6×buffer、上游引物、下游引物、ddH2O
2 实验过程
1.目的基因PCR扩增
使用Taq酶作为聚合酶进行PCR
2.扩增产物的纯化
3.目的基因与plBuscript连接
共分为三组，分别为：①实验组：Inser DNA片段的连接：PCR目的基因之后测得Inser DNA的浓度为37.7ng/ul，则Insert DNA使用量为0.7ul。②阳性对照：Control DNA片段的连接
③阴性对照：
4.大肠杆菌感受态细胞的制备
5.重组质粒转入感受态细胞
6.涂布37℃倒置培养，并进行蓝白斑筛选
由于第一第二实验组培养12小时的菌落大小不足以进行菌落PCR，故将这两组的培养时间延长至20小时
7.第一实验组进行菌落PCR、电泳。
8.第二实验组进行挑菌、摇菌
9.第二实验组进行菌液PCR、电泳
10.将电泳所得结果拍照、分析
3 结果与分析
本实验通过对目的基因进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳估测目的基因浓度大小、纯化目的基因、紫外分光光度计检测目的基因浓度、将目的基因与载体连接形成重组质粒、将重组质粒转化进大肠杆菌TOP10感受态细胞、进行蓝白斑筛选，这些步骤可以筛选出含有重组质粒的菌落，但由于可能出现假阳性，为确定菌中确实含有重组质粒，通过两种方式检测，一种为菌落PCR及电泳，一种为菌液PCR及电泳。
（1）由利用Tap酶进行目的基因PCR扩增后的电泳结果可看出，所提供的目的基因大小为200bp左右，整个凝胶板上的电泳条带都普遍模糊，可能是因为上样时时间间隔太长导致样品在电泳槽中扩散。为了保证后续实验进行，对于聚合酶的产物选择两个电泳条带最亮的进行后续实验。。
（2）对PCR产物进行纯化后，紫外分光光度计进行定量，测得以Tap酶为聚合酶的，DNA浓度为31.1ng/ul。重组质粒时，要求载体与目的基因质量比=1：1～1：5，或者物质的量比=1：1～1：5。根据计算，该 DNA浓度可进行重组质粒。
（3）由培养皿上菌落生长情况可知道，实验组出现了较多的白色菌落，且没有蓝色菌落；阳性对照组出现很多白色菌落，没有蓝色菌落；阴性对照组出现了少量的白色菌落，没有蓝色菌落。其中实验组和阳性对照组符合预先设想，出现白色菌落说明重组质粒转化进菌中，且转化效率较高；没有蓝色菌落出现说明重组质粒时反应时间够长，且载体与目的基因所用比例恰当，目的基因与载体连接很成功；长出来的菌落较密，说明感受态细胞制备结果较好，且制备完后马上进行转化，效果较好；阳性对照组中菌落更为密集，符合预期，效果更好。而阴性对照组本不应出现菌落，却出现了少量菌落，可能是由于在涂板时灭菌不够彻底，或无菌操作时操作失误。
（4）由菌落PCR、电泳之后的结果可看出，出现的条带显示为200bp左右，与原先提供的目的基因PCR电泳结果相同，说明这些菌落的菌中都转入了重组质粒，但部分条带很淡，有可能是因为挑菌出来进行PCR时，挑得太少，扩增之后DNA浓度较低；有些样品看不到条带，说明菌落为假阳性。因此，如果要保存转入了重组质粒的菌，以便以后可以使用，可选择有出现适当条带的菌落，进一步培养、保存。
（5）由菌液PCR、电泳之后的结果可看出，出现的条带显示为200bp左右，与原先提供的目的基因PCR电泳结果相同，说明这些菌液的菌中转入了重组质粒。而本小组分别使用锥形瓶和EP管作为培养菌液容器，空间大小不同，但最后菌液PCR后电泳出来的条带明暗相差不大，因此，在锥形瓶有限的情况下，可以用EP管作为容器进行培养。若培养时间有差，最后菌液PCR后电泳出来的条带有所差异，摇菌培养24小时后菌液PCR后电泳出来的条带较淡，可能是由于时间过长，氨苄青霉素作用变弱，逐渐有其他的菌出现，抢占大肠杆菌TOP10的资源，因此，摇菌培养时间最好不要超过24小时。菌落PCR后保存于4℃下24h的样品，电泳出来的条带与之前菌落PCR后马上电泳的相差不大，因此当有特殊情况无法及时电泳时，将样品存放于4℃下短暂保存，对实验结果影响不大。当然，在本次实验中，样本数少，可能还不具代表性，可以再进一步实验，进行研究探讨。
4 结论与讨论
由本次实验结果可得出，本次对小鼠组织、细胞中提取出的a基因进行克隆的实验实验结果较成功，使用Taq酶能对目的基因进行PCR；在涂布、摇菌等过程中要注意杂菌干扰，防止对实验结果造成影响；由蓝白斑筛选结果可知本次实验中目的基因与载体连接效率很高，但由电泳结果可知某些白色单菌落呈现假阳性；本次实验还证明菌落PCR、与菌液PCR都能成功扩增已转化成功目的基因，且菌液样品放于4℃下短暂保存，对实验结果影响不大。但本次实验中样本数少，仍不具代表性，可以再进一步实验，进行研究探讨
参考文献
[1] 黛艳梅，温博海，邱玲，等.立式立克次体外膜蛋白B基因片段的克隆与表达[J].《中国人兽共患病杂志》，2004，20（10）：839-842.