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【摘 要】：目的：建立上清丸的质量控制方法。方法：采用高效液相色谱法测定方中君药黄芩中黄芩苷的含量，同时对大黄和黄柏进行薄层色谱鉴别。结果：黄芩苷进样量在0．3384～0．9024μg（r＝0．9999）与峰面积呈良好的线性关系，平均加样回收率为：98．64％，RSD为0．88％（n＝6）；薄层色谱斑点清晰，阴性对照无干扰。结论：该方法准确，重现性好，可用于上清丸的质量控制。
【关键词】：上清丸质量标准薄层色谱法高效液相色谱法黄芩苷
【中图分类号】R914．1；R944．2＋2【文献标识码】A【文章编号】1007－8517（2008）08－0035－03
Quality Standards Research of Shangqing Pills
Xiao yan
Huaihua Institute for Drug Control，Hunan Huaihua，China 418000
Abstract Objective To establish the method for quality control of Shangqing Pills． MethodsThe Baicalin in Radix Scutellariae was determined byHPLC，while the Radix Et Rhizoma Rhei、Cortex Phellodendri Chinensis、were authenticated by TLC． ResultsDetermine by HPLC The linear rangers of Baicalin was 0．3384～0．9024μg（ r＝0．9999）． The average recoveries was 98．64％， with RSD ＝0．88％ n ＝ 6． The spot on the TLC plate was clearly．The negative contrast was not disturbed． Conclusions This method was accurate and has a good reproducibility．It can be used for quality control ofShangqing Pills ．
Key words Shangqing Pills； Quality standard； TLC；HPLC；Baicalin
上清丸收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第十册》1，是由菊花、黄芩、黄柏、大黄、薄荷、川芎、白芷、荆芥、防风、桔梗、连翘、栀子等十二味中药组方而制成的大蜜丸，具有清热散风，解毒，通便的功效。对头晕耳鸣，目赤，鼻窦炎，口舌生疮，牙龈肿痛，大便秘结有很好的作用。该标准只有丸剂的通则检查，尚无定性鉴别及定量指标，为有效控制该制剂的质量，本文参照药典用薄层色谱法对其中的大黄、黄柏进行定性鉴别，采用高效液相色谱法（HPLC法）对黄芩中的黄芩苷进行含量测定，为该产品的质量控制提供客观的定性定量评价方法。
1 仪器与试药
LC－10ATVP 高效液相色谱仪，SPD－10AVP检测器（日本岛津），N3000工作站；SK3300H超声波清洗器（上海科导超声仪有限公司）。大黄、黄柏对照药材（中国药品生物制品检定所，批号分别为902－8901、0937－9703）；盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号为713－200208）；黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号为110715－200212）；上清丸（九芝堂股份有限公司 批号为20070906、20071108、20070407）；阴性对照自制；硅胶G（青岛海洋化工有限公司）；硅胶H（青岛海洋化工有限公司）；羧甲基纤维素钠（CMC－Na，上海化学试剂厂）；甲醇、磷酸、冰醋酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水；其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2．1 薄层色谱鉴别
2．1．1 大黄的鉴别 取本品2g，剪碎，加甲醇50mL，超声处理20min，滤过，取滤液5mL蒸干，残渣加水10mL使溶解，加盐酸1mL，水浴中加热30min，立即冷却，用乙醚20mL分2次提取，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL溶解，作为供试品溶液2。同法制得缺大黄的阴性对照品溶液。另取大黄对照药材0．1g，加甲醇20mL，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（1551）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。用氨气熏蒸后，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照品无干扰，见图1A。
2．1．2 黄柏的鉴别 取本品2g，剪碎，加甲醇10mL，加热回流15min，放冷，滤过，滤液浓缩至5mL，作为供试品溶液2。同法制得缺黄柏的阴性对照品溶液。另取黄柏对照药材0．1g，同法制成对照药材溶液；取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0．5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－浓氨溶液（126333）为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸中展开，取出，晾干。置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照品无干扰，见图1B。
2．2 黄芩苷含量测定
2．2．1 色谱条件 色谱柱：DikmaDiamonsilTM（钻石）C18柱（250mm×4．6mm，5μm）；流动相：甲醇－水－冰醋酸（55451）；流速：1．0ml·min－1；柱温：30℃；检测波长：274nm；进样量：10μL。按黄芩苷峰计算，理论板数不低于4000。
2．2．2 溶液制备2 精密称取经五氧化二磷减压干燥16小时的黄芩苷对照品5．64mg，置100mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含黄芩苷0．0564mg的对照品溶液。取重量差异项下的本品，剪碎，混匀，取约0．5g，精密称定，精密加稀乙醇50mL，称定重量，超声处理30min，加热回流1h，放冷，称定重量，用稀乙醇补足重量，用微孔滤膜（0．45μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺黄芩阴性样品适量，照供试品溶液制备方法制得阴性供试品溶液。
2．2．3 方法学考察 阴性干扰实验：分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10μL，按上述色谱条件分别进样测定并记录色谱图。结果显示，阴性对照溶液对测定结果无干扰。（见图2）
线性关系考察：精密吸取上述对照品溶液6．0，8．0，10．0，12．0，14．0、16．0μL，分别注入液相色谱仪测定，在上述色谱条件下测定峰面积，以进样量为横坐标（X）、峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y＝3233518．6X－6289．8，r＝0．9999（n＝6），结果表明黄芩苷在0．3384μg～0．9024μg范围内与峰面积线性关系良好。
精密度试验：按上述色谱条件，用同一供试品溶液连续进样6次，每次10μL，分别测得各次峰面积。结果的RSD为0．75％，表明仪器精密度良好。
稳定性试验：取同一批供试品溶液（批号为20070906），分别在0，2，4，8，10，12h时进样1次，测定峰面积。结果黄芩苷的峰面积无显著变化，RSD为1．05％，表明供试品溶液在12h内稳定。
重现性试验：取同一批样品（批号为20070906），按供试品溶液制备方法，平行制备6份，依法测定并计算。结果RSD为1．31％，表明本法重现性良好。
加样回收试验：取已知含量的同批（批号为20070906，含量为5．02mg·g－1）样品约0．25g，精密称定，分别精密加入黄芩苷对照品溶液（1．25mg·mL－1）0．8mL、0．8mL、1mL、1mL、1．2mL、1．2mL，按供试品溶液制备方法制备供试液，依法进行含量测定并计算回收率。结果见表1。
2．2．4样品含量测定
精密称取3批上清丸样品，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取10μL，注入液相色谱仪测定，以外标法计算样品中黄芩苷的含量。结果批号为20070906，20071108，20070407的3批样品中黄芩苷的含量分别为：45．60，46．58，45．07 mg·丸－1。
3 讨论
3．1 对本品的薄层定性鉴别均进行了阴性对照试验，结果各薄层色谱斑点清晰，专属性强，重现性好，不含被测成分的阴性对照品无干扰。
3．2 黄芩苷为一种葡萄糖醛酸结构的黄酮衍生物，具有显著的生物活性，其水溶性极小，具有一定的脂溶性。本实验曾选用乙醇和稀乙醇溶为溶媒提取，结果以稀乙醇提取的含量完全。
3．3 在含量测定试验中，流动相曾比较了甲醇－水－冰醋酸、乙腈－磷酸溶剂系统，以及多种不同比例的配比，结果两者效果都比较理想。但考虑到乙腈的毒性较甲醇大，且价格较甲醇昂贵，因此选用甲醇－水－冰醋酸溶剂系统。经试验，选用甲醇－水－冰醋酸（55：45：1）为流动相，黄芩苷峰形良好，保留时间适宜，与其它组分均能达到基线分离，理论板数为4768。
3．4方法学研究表明，所采用的薄层鉴别、含量测定方法的专属性较强，简便准确，重现性好，可作为上清丸的质量控制方法。
参考文献
1国家药典委员会． 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十册S．北京：人民卫生出版社，19958．
2国家药典委员会． 中华人民共和国药典一部M． 北京：化学工业出版社，2005：329、330、142、211
（收稿日期：2008．3．19）
【关键词】：上清丸质量标准薄层色谱法高效液相色谱法黄芩苷
【中图分类号】R914．1；R944．2＋2【文献标识码】A【文章编号】1007－8517（2008）08－0035－03
Quality Standards Research of Shangqing Pills
Xiao yan
Huaihua Institute for Drug Control，Hunan Huaihua，China 418000
Abstract Objective To establish the method for quality control of Shangqing Pills． MethodsThe Baicalin in Radix Scutellariae was determined byHPLC，while the Radix Et Rhizoma Rhei、Cortex Phellodendri Chinensis、were authenticated by TLC． ResultsDetermine by HPLC The linear rangers of Baicalin was 0．3384～0．9024μg（ r＝0．9999）． The average recoveries was 98．64％， with RSD ＝0．88％ n ＝ 6． The spot on the TLC plate was clearly．The negative contrast was not disturbed． Conclusions This method was accurate and has a good reproducibility．It can be used for quality control ofShangqing Pills ．
Key words Shangqing Pills； Quality standard； TLC；HPLC；Baicalin
上清丸收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第十册》1，是由菊花、黄芩、黄柏、大黄、薄荷、川芎、白芷、荆芥、防风、桔梗、连翘、栀子等十二味中药组方而制成的大蜜丸，具有清热散风，解毒，通便的功效。对头晕耳鸣，目赤，鼻窦炎，口舌生疮，牙龈肿痛，大便秘结有很好的作用。该标准只有丸剂的通则检查，尚无定性鉴别及定量指标，为有效控制该制剂的质量，本文参照药典用薄层色谱法对其中的大黄、黄柏进行定性鉴别，采用高效液相色谱法（HPLC法）对黄芩中的黄芩苷进行含量测定，为该产品的质量控制提供客观的定性定量评价方法。
1 仪器与试药
LC－10ATVP 高效液相色谱仪，SPD－10AVP检测器（日本岛津），N3000工作站；SK3300H超声波清洗器（上海科导超声仪有限公司）。大黄、黄柏对照药材（中国药品生物制品检定所，批号分别为902－8901、0937－9703）；盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号为713－200208）；黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号为110715－200212）；上清丸（九芝堂股份有限公司 批号为20070906、20071108、20070407）；阴性对照自制；硅胶G（青岛海洋化工有限公司）；硅胶H（青岛海洋化工有限公司）；羧甲基纤维素钠（CMC－Na，上海化学试剂厂）；甲醇、磷酸、冰醋酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水；其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2．1 薄层色谱鉴别
2．1．1 大黄的鉴别 取本品2g，剪碎，加甲醇50mL，超声处理20min，滤过，取滤液5mL蒸干，残渣加水10mL使溶解，加盐酸1mL，水浴中加热30min，立即冷却，用乙醚20mL分2次提取，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1mL溶解，作为供试品溶液2。同法制得缺大黄的阴性对照品溶液。另取大黄对照药材0．1g，加甲醇20mL，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（1551）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。用氨气熏蒸后，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照品无干扰，见图1A。
2．1．2 黄柏的鉴别 取本品2g，剪碎，加甲醇10mL，加热回流15min，放冷，滤过，滤液浓缩至5mL，作为供试品溶液2。同法制得缺黄柏的阴性对照品溶液。另取黄柏对照药材0．1g，同法制成对照药材溶液；取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0．5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－浓氨溶液（126333）为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸中展开，取出，晾干。置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照品无干扰，见图1B。
2．2 黄芩苷含量测定
2．2．1 色谱条件 色谱柱：DikmaDiamonsilTM（钻石）C18柱（250mm×4．6mm，5μm）；流动相：甲醇－水－冰醋酸（55451）；流速：1．0ml·min－1；柱温：30℃；检测波长：274nm；进样量：10μL。按黄芩苷峰计算，理论板数不低于4000。
2．2．2 溶液制备2 精密称取经五氧化二磷减压干燥16小时的黄芩苷对照品5．64mg，置100mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含黄芩苷0．0564mg的对照品溶液。取重量差异项下的本品，剪碎，混匀，取约0．5g，精密称定，精密加稀乙醇50mL，称定重量，超声处理30min，加热回流1h，放冷，称定重量，用稀乙醇补足重量，用微孔滤膜（0．45μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺黄芩阴性样品适量，照供试品溶液制备方法制得阴性供试品溶液。
2．2．3 方法学考察 阴性干扰实验：分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10μL，按上述色谱条件分别进样测定并记录色谱图。结果显示，阴性对照溶液对测定结果无干扰。（见图2）
线性关系考察：精密吸取上述对照品溶液6．0，8．0，10．0，12．0，14．0、16．0μL，分别注入液相色谱仪测定，在上述色谱条件下测定峰面积，以进样量为横坐标（X）、峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y＝3233518．6X－6289．8，r＝0．9999（n＝6），结果表明黄芩苷在0．3384μg～0．9024μg范围内与峰面积线性关系良好。
精密度试验：按上述色谱条件，用同一供试品溶液连续进样6次，每次10μL，分别测得各次峰面积。结果的RSD为0．75％，表明仪器精密度良好。
稳定性试验：取同一批供试品溶液（批号为20070906），分别在0，2，4，8，10，12h时进样1次，测定峰面积。结果黄芩苷的峰面积无显著变化，RSD为1．05％，表明供试品溶液在12h内稳定。
重现性试验：取同一批样品（批号为20070906），按供试品溶液制备方法，平行制备6份，依法测定并计算。结果RSD为1．31％，表明本法重现性良好。
加样回收试验：取已知含量的同批（批号为20070906，含量为5．02mg·g－1）样品约0．25g，精密称定，分别精密加入黄芩苷对照品溶液（1．25mg·mL－1）0．8mL、0．8mL、1mL、1mL、1．2mL、1．2mL，按供试品溶液制备方法制备供试液，依法进行含量测定并计算回收率。结果见表1。
2．2．4样品含量测定
精密称取3批上清丸样品，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取10μL，注入液相色谱仪测定，以外标法计算样品中黄芩苷的含量。结果批号为20070906，20071108，20070407的3批样品中黄芩苷的含量分别为：45．60，46．58，45．07 mg·丸－1。
3 讨论
3．1 对本品的薄层定性鉴别均进行了阴性对照试验，结果各薄层色谱斑点清晰，专属性强，重现性好，不含被测成分的阴性对照品无干扰。
3．2 黄芩苷为一种葡萄糖醛酸结构的黄酮衍生物，具有显著的生物活性，其水溶性极小，具有一定的脂溶性。本实验曾选用乙醇和稀乙醇溶为溶媒提取，结果以稀乙醇提取的含量完全。
3．3 在含量测定试验中，流动相曾比较了甲醇－水－冰醋酸、乙腈－磷酸溶剂系统，以及多种不同比例的配比，结果两者效果都比较理想。但考虑到乙腈的毒性较甲醇大，且价格较甲醇昂贵，因此选用甲醇－水－冰醋酸溶剂系统。经试验，选用甲醇－水－冰醋酸（55：45：1）为流动相，黄芩苷峰形良好，保留时间适宜，与其它组分均能达到基线分离，理论板数为4768。
3．4方法学研究表明，所采用的薄层鉴别、含量测定方法的专属性较强，简便准确，重现性好，可作为上清丸的质量控制方法。
参考文献
1国家药典委员会． 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十册S．北京：人民卫生出版社，19958．
2国家药典委员会． 中华人民共和国药典一部M． 北京：化学工业出版社，2005：329、330、142、211
（收稿日期：2008．3．19）