目的:探索以胶原海绵为支架、新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞,于体外构建工程化心肌组织的方法.方法:实验于2005-12/2006-11在解放军第四军医大学西京医院心内科实验室完成.Ⅰ型胶原海绵剪切成方形片状(2.0 cm×1.4 cm×0.2 cm),经60Co照射消毒,于DMEM培养液中水化1 h左右.另取1 d龄SD大鼠心脏,剪成小碎块,然后用2.5 g/L胰蛋白酶于37℃中消化,吸取上清至含胎牛血清的DMEM中,重复消化四五次,用差速贴壁法除去大部分成纤维细胞,将细胞沉淀用DMEM培养液以2×109 L-1的密度悬浮备用.将上述的心肌细胞悬液1 mL缓慢滴注于玻璃模型中的胶原海绵上,然后置于细胞培养中培养.肉眼及显微镜主要观察工程化心肌组织在培养期间的自发收缩情况,包括收缩的部位、强度、频率、一致性以及收缩随时间变化的情况.苏木精-伊红染色观察工程化心肌组织内胶原纤维的变化,细胞形态,胞核的形状及细胞之间的连接.免疫组织化学染色和透射电镜观察工程化心肌组织片的形态和功能.结果:①细胞接种于胶原海绵上1 d后,细胞/胶原复合物的凝胶化过程基本完毕,体积保持恒定,维持至培养结束,第3天细胞/胶原复合物局部出现点片状自发收缩,第5天整个细胞/胶原复合物出现同步化自发收缩,收缩频率61～199次/min.2周后37.5%的工程化心肌组织的自发收缩活动减弱,但75%的工程化心肌组织的自发收缩活动持续至培养结束.②苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色和透射电子显微镜显示,工程化心肌组织内细胞间连接广泛存在,细胞多呈纵向分布,胞核呈长圆形,胞浆内α-肌节肌动蛋白阳性,胞内肌原纤维排列整齐,可见到心肌特异性的肌小节结构和Z线,多数细胞具有分化的心肌细胞表型.结论:用新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞、以Ⅰ型胶原海绵为支架材料,构建出的工程化心肌组织,于体外可长时间持续自发收缩,该细胞/胶原复合物的形态结构与生理功能均类似于成熟大鼠心肌组织.