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摘要：从禽肉加工厂的污泥中分离到174株能在牛奶琼脂平板产透明圈微生物菌株，其中42株具有分解羽毛的能力，从中筛选出13株具有较强羽毛降解能力的菌株，均能在48 h内将羽毛完全分解。16S rDNA的BLAST比对及系统发育树分析结果显示，8株菌为寡养单胞菌属（Stenotrophomonas），1株菌为芽孢杆菌属（Bacillus），4株菌为气单胞菌属（Aeromonas）。
关键词：羽毛降解菌；16S rDNA；发育树
中图分类号：Q939.9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0068-04
羽毛是养殖业的废弃物，但同时又是一种很好的饲料蛋白原料和化工资源。我国每年的羽毛总量超过100万吨[1]，而且随着集约化养殖的快速发展，产量逐年增加。羽毛主要成分是角蛋白质，其半胱氨酸形成高度交联的二硫键，难以被普通蛋白水解酶分解，如果不经过处理动物很难消化和利用[2]。常规处理羽毛的方式为酸碱水解或高温高压蒸煮，耗能高而且易引起严重环境污染。自然界中的某些微生物能分泌角蛋白酶将角蛋白质缓慢分解，因此筛选具有高效分解羽毛能力的微生物一直是该领域研究的基础工作。自然环境中降解角蛋白的微生物普遍存在，包括真菌、细菌和放线菌等[2～5]。近年来，随着人们对羽毛类废弃物资源循环利用价值认识的深入，越来越多的羽毛分解菌被分离纯化培养，从而为羽毛分解机制研究及其开发利用提供越来越丰富的微生物资源。但未见典型环境条件下降解羽毛微生物多样性及优势种群的报道。
本研究从家禽屠宰厂污泥池典型环境取样，筛选分离具有羽毛降解能力的微生物菌株，通过16S rDNA的BLAST比对及系统发育树进行微生物多样性分析，为研究羽毛降解机理和微生物资源开发利用提供理论基础。
1材料与方法
1.1样品及菌株分离
样品采集于山东六和平度屠宰厂污泥沉淀池。取5 g污泥样品，加到装有95 ml灭菌水和玻璃珠的三角瓶中，180 r/min振荡30 min，做成悬液；将上清液梯度稀释，100 μl涂布牛奶平板，30℃ 倒置培养36 h；挑取水解圈比较大的菌落点接牛奶固体平板；挑取牛奶平板上水解圈较大的菌落接种到含有羽毛粉液体培养基的三角瓶中，180 r/min、30℃摇床培养，筛选能降解羽毛粉的菌株。将具有分解羽毛粉能力的菌株接种到含有完整羽毛的三角瓶中（培养条件同上）进一步筛选，观察羽毛降解情况。牛奶琼脂培养基和羽毛粉液体培养基的配制参见黄亦钧等（2009）[6]的方法。
1.2菌株、质粒和材料
细菌和质粒见表1。E. coli菌株于LB培养基37℃培养。安苄青霉素终浓度为100 μg/ml。T-载体、Taq酶和T4 DNA连接酶均购自大连TaKaRa公司；DNA Marker、Pfu酶和DNA回收试剂盒均购自北京全式金公司。
3结论与讨论
本研究从家禽屠宰厂污泥沉淀池这一典型环境中分离到174株产蛋白酶的菌株，利用羽毛培养进一步筛选，得到42株具有羽毛分解能力的菌株，说明了特定环境下功能微生物的聚落（cluster）特点。对其中分解羽毛能力强的13株菌进行16S rDNA序列分析，BLAST比对结果表明，8株（61.5%）属于寡养单胞菌属（Stenotrophomonas），4株属于气单胞菌属（Aeromonas），1株属于芽孢杆菌属（Bacillus），说明该环境中分解羽毛的微生物存在一定程度的多样性及优势种群。
系统发育树分析发现，SDK02、SDK03、SDK04、SDK05、SDK06、SDK07、SDK08、SDK09与嗜麦芽寡养单胞菌亲缘关系最近。嗜麦芽寡养单胞菌属于革兰氏阴性原核微生物，是一类条件致病菌[10]，已有关于该菌具有分解羽毛能力及角蛋白酶基因克隆的报道[11，12]；而且S. maltophilia 能分解有毒化合物和高分子的多环芳香烃[13，14]，也是潜在的生物杀虫剂和环境修复微生物资源。菌株SDK12与枯草芽孢杆菌亲缘关系最近，可归为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌属于应用广泛的益生菌，其降解羽毛的机理和发酵代谢均有报道[1，15，16]。菌株SDK01、SDK10、SDK11、SDK13为杀鲑气单胞菌，目前尚未见该类菌具有降解羽毛功能的研究报道，是一类新的有待研究与开发的微生物资源。
致谢：黄亦钧博士、许丽红硕士为本研究做了部分实验工作，在此表示感谢。
参考文献：
[1]Cedrola S M L， Melo C A N， Mazotto A M， et al. Keratinases and sulfide from Bacillus subtilis SLC to recycle feather waste [J]. World J. Microbiol. Biotechnol.， 2012， 28：1259-1269.
[2]Muhsin T M， Hadi R B. Degradation of keratin substrates by fungi isolated from sewage sludge[J]. Mycopathologia，2002， 154（4）： 185-189.
[3]Ignatova Z， Gousterova A， Spassov G， et al. Isolation and partial characterization of extracellular keratinase from a wool degraging thermophilic actimomycete strain Thermoatinomyces candidus[J]. Canadian Journal of Microbiology，1999， 45 （3）： 217-222.
关键词：羽毛降解菌；16S rDNA；发育树
中图分类号：Q939.9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0068-04
羽毛是养殖业的废弃物，但同时又是一种很好的饲料蛋白原料和化工资源。我国每年的羽毛总量超过100万吨[1]，而且随着集约化养殖的快速发展，产量逐年增加。羽毛主要成分是角蛋白质，其半胱氨酸形成高度交联的二硫键，难以被普通蛋白水解酶分解，如果不经过处理动物很难消化和利用[2]。常规处理羽毛的方式为酸碱水解或高温高压蒸煮，耗能高而且易引起严重环境污染。自然界中的某些微生物能分泌角蛋白酶将角蛋白质缓慢分解，因此筛选具有高效分解羽毛能力的微生物一直是该领域研究的基础工作。自然环境中降解角蛋白的微生物普遍存在，包括真菌、细菌和放线菌等[2～5]。近年来，随着人们对羽毛类废弃物资源循环利用价值认识的深入，越来越多的羽毛分解菌被分离纯化培养，从而为羽毛分解机制研究及其开发利用提供越来越丰富的微生物资源。但未见典型环境条件下降解羽毛微生物多样性及优势种群的报道。
本研究从家禽屠宰厂污泥池典型环境取样，筛选分离具有羽毛降解能力的微生物菌株，通过16S rDNA的BLAST比对及系统发育树进行微生物多样性分析，为研究羽毛降解机理和微生物资源开发利用提供理论基础。
1材料与方法
1.1样品及菌株分离
样品采集于山东六和平度屠宰厂污泥沉淀池。取5 g污泥样品，加到装有95 ml灭菌水和玻璃珠的三角瓶中，180 r/min振荡30 min，做成悬液；将上清液梯度稀释，100 μl涂布牛奶平板，30℃ 倒置培养36 h；挑取水解圈比较大的菌落点接牛奶固体平板；挑取牛奶平板上水解圈较大的菌落接种到含有羽毛粉液体培养基的三角瓶中，180 r/min、30℃摇床培养，筛选能降解羽毛粉的菌株。将具有分解羽毛粉能力的菌株接种到含有完整羽毛的三角瓶中（培养条件同上）进一步筛选，观察羽毛降解情况。牛奶琼脂培养基和羽毛粉液体培养基的配制参见黄亦钧等（2009）[6]的方法。
1.2菌株、质粒和材料
细菌和质粒见表1。E. coli菌株于LB培养基37℃培养。安苄青霉素终浓度为100 μg/ml。T-载体、Taq酶和T4 DNA连接酶均购自大连TaKaRa公司；DNA Marker、Pfu酶和DNA回收试剂盒均购自北京全式金公司。
3结论与讨论
本研究从家禽屠宰厂污泥沉淀池这一典型环境中分离到174株产蛋白酶的菌株，利用羽毛培养进一步筛选，得到42株具有羽毛分解能力的菌株，说明了特定环境下功能微生物的聚落（cluster）特点。对其中分解羽毛能力强的13株菌进行16S rDNA序列分析，BLAST比对结果表明，8株（61.5%）属于寡养单胞菌属（Stenotrophomonas），4株属于气单胞菌属（Aeromonas），1株属于芽孢杆菌属（Bacillus），说明该环境中分解羽毛的微生物存在一定程度的多样性及优势种群。
系统发育树分析发现，SDK02、SDK03、SDK04、SDK05、SDK06、SDK07、SDK08、SDK09与嗜麦芽寡养单胞菌亲缘关系最近。嗜麦芽寡养单胞菌属于革兰氏阴性原核微生物，是一类条件致病菌[10]，已有关于该菌具有分解羽毛能力及角蛋白酶基因克隆的报道[11，12]；而且S. maltophilia 能分解有毒化合物和高分子的多环芳香烃[13，14]，也是潜在的生物杀虫剂和环境修复微生物资源。菌株SDK12与枯草芽孢杆菌亲缘关系最近，可归为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌属于应用广泛的益生菌，其降解羽毛的机理和发酵代谢均有报道[1，15，16]。菌株SDK01、SDK10、SDK11、SDK13为杀鲑气单胞菌，目前尚未见该类菌具有降解羽毛功能的研究报道，是一类新的有待研究与开发的微生物资源。
致谢：黄亦钧博士、许丽红硕士为本研究做了部分实验工作，在此表示感谢。
参考文献：
[1]Cedrola S M L， Melo C A N， Mazotto A M， et al. Keratinases and sulfide from Bacillus subtilis SLC to recycle feather waste [J]. World J. Microbiol. Biotechnol.， 2012， 28：1259-1269.
[2]Muhsin T M， Hadi R B. Degradation of keratin substrates by fungi isolated from sewage sludge[J]. Mycopathologia，2002， 154（4）： 185-189.
[3]Ignatova Z， Gousterova A， Spassov G， et al. Isolation and partial characterization of extracellular keratinase from a wool degraging thermophilic actimomycete strain Thermoatinomyces candidus[J]. Canadian Journal of Microbiology，1999， 45 （3）： 217-222.