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摘要 [目的]对枯草芽孢杆菌BS11抗真菌活性物质进行研究，为该菌株的进一步开发应用提供参考。[方法]比较了枯草芽孢杆菌BS11在LB和NB培养基上的生长情况，比较了3种方法提取该菌株活性物质的效果，并探讨了该菌株的最佳培养条件。[结果]以香蕉枯萎病菌为指示菌，发现拮抗菌在LB和NA 2种不同培养基中有很明显的差别，LB培养基中生长繁殖速度快，但上清液活性很低，NA培养基中繁殖速度较慢，上清液活性却较好；乙醇沉淀法和乙酸乙酯萃取法均不能提取到活性物质，硫酸铵沉淀法基本上可将活性物质提取出来；BS11最佳的培养条件为初始pH7，温度30 ℃，通气量60 ml；发酵上清液有蛋白酶、纤维素酶活性，但没有几丁质酶活性。[结论]枯草芽孢杆菌BS11株所产的抗真菌活性物质具有性质稳定、广谱、易于提取等优点，为其应用于植物病害防治提供了理论依据。
关键词 枯草芽孢杆菌；培养条件；酶活性检测
中图分类号 S482.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）35-12505-03
芽孢杆菌作为植物病害生防菌的研究越来越多，涉及的防治对象包括叶部、根部等多种气传、土传植物病害。芽孢杆菌对环境无污染，具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力[1]。其芽孢可以制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型或与化学农药混用而不失活。随着“绿色植保” 和“公共植保”观念的增强，枯草芽孢杆菌作为生物防治的潜在优势备受关注。近年来，国内外学者就枯草芽孢杆菌防治植物病害方面进行了大量研究，并已开发出多种商品化菌剂应用于农业生产[2-4]。枯草芽孢杆菌BS11是海南省热带生物资源可持续利用重点实验室分离的对香蕉枯萎病、橡胶炭疽、芒果炭疽、辣椒炭疽、橡胶棒孢等有较好抑制作用的拮抗菌，笔者对其抗真菌活性物质进行了初步研究，旨在为该菌株的进一步研究与开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株。
枯草芽孢杆菌BS11由海南省热带生物资源可持续利用重点实验室分离，指示菌香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌、橡胶炭疽病菌、芒果炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、橡胶棒孢病菌均由该实验室保存。
1.1.2 培养基。
PDA 培养基、NB培养基、LB培养基、蛋白酶培养基、几丁质培养基、羧甲基纤维素培养基均按文献所述方法配制[5-8]。
1.2 方法
1.2.1 抑菌效果的测定。采用琼脂孔扩散对峙法[9]。
将香蕉枯萎病病菌菌饼（ф=8 mm）接种于 PDA 平板中央，在菌饼周围 2 cm 处均匀打 4个孔（ф=8 mm），将待测物注入孔内，每孔40 μl，将平板置于密封的塑料袋于28 ℃培养2～4 d，观察到有抑菌圈出现为止。测量抑菌带宽度，以抑菌带宽度大小评价抑菌效果。
1.2.2 NB和LB培养基中的生长曲线及其上清液的抑菌活性。
将种子菌悬液以2%转接于NB和LB液体发酵培养基（250 ml摇瓶装液量60 ml），28 ℃、200 r/min 条件下振荡培养，于不同的时间取出小份样品分别测其A600值和抑菌活性。
1.2.3 抑菌活性物质的粗提[10-14]。
1.2.3.1 硫酸铵沉淀法。
在无菌活性上清液中加入硫酸铵至饱和度70%，4 ℃静置过夜。4 ℃、10 000 r/min离心20 min，收集沉淀，将沉淀用1/15的磷酸盐缓冲液（pH 6.8、0.02 mol/L）溶解，透析脱盐即得粗提液，测其抑菌活性。
1.2.3.2 乙醇沉淀法。
在无菌活性上清液中加入3倍体积的95%乙醇，使乙醇的终浓度为70%，4 ℃静置过夜沉淀。4 ℃、10 000 r/min离心20 min，干燥后用少量磷酸盐缓冲液（pH 6.8、0.02 mol/L）溶解，测其抑菌活性。
1.2.3.3 乙酸乙酯萃取。在无菌活性上清液中加入等体积的乙酸乙酯于分液漏斗振荡混匀，过夜，收集乙酸乙酯层，水温50 ℃真空旋转浓缩至体积不再变化，用少量甲醇洗出，加蒸馏水调至甲醇浓度为10%，调pH为7.0，用稀释液做活性测定，以无菌水和10%甲醇水溶液作对照。
1.2.4 培养条件对BS11菌株产生抑菌活性物质的影响[15-17]。
1.2.4.1 培养基初始pH对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
用HCl和NaOH溶液将培养液pH分别调至4、5、6、7、8、9，在250 ml三角瓶中分别装入100 ml培养基，将种子液以2%的比例接入到培养基中，于30 ℃振荡培养48 h。
1.2.4.2 培养温度对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
在250 ml三角瓶中分别装入100 ml培养基，将种子液以2%的比例接入到培养基中，于28、30、32、34、36 ℃振荡培养48 h。
1.2.4.3 不同装液量对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
在250 ml三角瓶中分别装入20、40、60、80、100 ml培养基，将种子液以2%的比例接入到培养基中，于30 ℃振荡培养48 h。
1.2.5 活性上清液的蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶的检测。
1.2.5.1 蛋白酶活性检测[6]。
在蛋白酶培养基上打孔，将活性上清液注入孔中，28 ℃ 培养2 d，观察孔周围是否产生透明圈。
1.2.5.2 纤维素酶（β-1，4-葡聚糖酶）活性检测[8]。
在羧甲基纤维素培养基上打孔，将活性上清液注入孔中，28 ℃ 培养2 d，用 1 mg/ml 刚果红染色 20 min，再用 1 mol/L NaCl浸泡15 min，用水洗去表面附着的刚果红，观察孔周围是否产生透明圈。 1.2.5.3 几丁质酶活性检测[7]。
在几丁质培养基上打孔，将活性上清液注入孔中，28 ℃ 培养 2 d，用 1 mg/ml 刚果红染色 20 min，再用1 mol/L NaCl 浸泡15 min，用水洗去表面附着的刚果红，观察孔周围是否产生透明圈。
2 结果与分析
2.1 枯草芽孢杆菌BS11的抑菌活性 用平板对峙试验对枯草芽孢杆菌BS11菌株对芒果炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、橡胶炭疽病菌、橡胶棒孢病菌进行了初步研究，发现其对以上4种常见的植物真菌病害都有较好的抑制作用（图1）。
2.2 LB和NB培养基中生长曲线以及抑菌物质的活性测定
由图2可知，拮抗菌BS11在LB培养基上生长繁殖速度快，但抑菌活性很差；在NB培养基上生长繁殖速度相对较慢，抑菌活性却相对较好，表明活性物质的产量与菌量不成正比。
2.3 抑菌活性物质的粗提
将枯草芽孢杆菌BS11菌株的培养上清液经0.22 μm的微孔滤膜过滤后，分别用乙醇、乙酸乙酯和硫酸铵沉淀后，发现乙醇沉淀和乙酸乙酯萃取物均不能检测到抑菌活性，而硫酸铵沉淀法则能检测到较好的抑菌活性（图3），说明硫酸铵沉淀法基本上可将活性物质提取出来，该活性物质有可能是蛋白质。
2.4 培养条件对BS11菌株产生抑菌活性物质的影响
2.4.1 培养基初始pH对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
以NB为培养基，初始pH为4时拮抗菌BS11不生长，pH为7时抑菌活性最好，偏酸偏碱都不利于活性物质的生成，相比较而言碱性条件下更不利于活性物质的生成（图4）。
2.4.2 培养温度对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
在微生物的培养温度中，有最高、最适与最低培养温度之分，而最适培养温度则是其分裂一代所需的最短时间的培养温度，不同的微生物生长繁殖所需的最适温度也是各异的。由图5可知，30 ℃时拮抗菌BS11抑菌活性最好。
2.4.3 不同装液量对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
在NB中拮抗菌BS11最适的装液量为60 ml，枯草芽孢杆菌是好氧性细菌，摇瓶中的氧气量将直接影响细菌的生长和活性物质的产生。试验结果表明，250 ml 三角瓶中装入 60 ml 的培养液最适于抗菌蛋白的产生，随着装液量增加，瓶中空气量减少，菌体生长受到影响，活性物质产量减小，装液量过少，活性物质产量也少（图6）。
2.5 活性粗提液的蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶活性的检测
2.5.1 蛋白酶活性检测。
在蛋白酶培养基琼脂孔周围中有透明圈产生（图7），说明发酵液中含有能够分解蛋白的酶。
2.5.2 纤维素酶活性检测。在羧甲基纤维素培养基琼脂孔周围中有透明圈产生（图8），说明发酵液中含有能够分解羧甲基纤维素的蛋白酶。
2.5.3 几丁质酶活性检测。发酵液中未能检测到能够分解几丁质的酶。
3 结论与讨论
枯草芽孢杆菌BS11菌株在LB培养基中很快就进行大量繁殖，生长良好但是抑菌活性却很低，NB培养基与LB培养基相比生长繁殖速度较慢而抑菌活性较好。由此可见，拮抗菌活性物质的产生与菌体生长繁殖速度不成正比关系。在LB培养基中检测到的活性物质活性较低，可能是由于该活性物质属于诱导表达[18]，而LB培养基中没有诱导该活性物质表达所需的元素，也可能是LB培养基中有抑制活性物质表达的成分。乙醇沉淀法和乙酸乙酯萃取法都不能将活性物质提取出来，而硫酸铵沉淀法可以将活性物质提取出来，初步判断枯草芽孢杆菌BS11菌株所产生的活性物质有可能不是化学化合物而是蛋白质类物质。对枯草芽孢杆菌BS11菌株培养上清中与抗菌活性有关的蛋白酶、纤维素酶以及几丁质酶活性进行检测，发现具有抗菌活性的上清中有蛋白酶活性和纤维素酶活性无几丁质酶活性，可以排除抗真菌活性物质是几丁质酶的可能。该试验通过对香蕉枯萎病拮抗菌株BS11抗真菌活性物质的研究，发现该活性物质具有广谱的抗真菌活性、性质稳定、易提取等特点，具有潜在的商业化应用价值。
参考文献
[1]
程洪斌，刘哓桥，陈红漫.枯草芽孢杆菌防治植物真菌病害研究进展[J].上海农业学报，2006，22（1）：109-112.
[2] 谌晓曦，陈卫良，李德葆，等.357 细菌及其拮抗物质对植物病原真菌的抑制[J].微生物学报，2003，30（3）：67-71.
[3] 陈雪丽，王光华，金剑，等.多粘类芽孢杆菌BRF-1和枯草芽孢杆菌BRF-2对黄瓜和番茄枯萎病的防治效果[J].中国生态农业学报，2008，16（2）：446-450.
[4] 高学文，姚仕义，HUONG PHAM，等.枯草芽孢杆菌B2菌株产生的抑菌活性物质分析[J].中国生物防治，2003，19（4）：175-179.
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[7] 顾真荣，马承铸，韩长安，等.产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定[J].上海农业学报，2001，17（3）：92-96.
[8] 王毅，刘云国，习兴梅，等.枯草芽胞杆菌降解木质纤维素能力及产酶研究[J].微生物学杂志，2008（4）：1-6.
[9] 黎起秦，陈永宁，林纬，等.西瓜枯萎病生防细菌的筛选[J].广西农业生物科学，2000，19（2）：81-84.
[10] 郭勇.现代生化技术[M].北京：科学出版社，2005：9-13.
[11] 何青芳，陈卫良，马志超，等. 枯草芽孢杆菌 A30 菌株产生的拮抗肽的分离纯化与理化性质研究[J].中国水稻科学，2002，16（4）：361-365.
[12] 何红，蔡学清，关雄，等.内生菌 BS2 2菌株的抗菌蛋白及其防病作用[J].植物病理学报，2003，33（4）：373-378.
[13] 刘静，王军，姚建明，等.枯草芽孢杆菌 JA 抗菌物特定及抗菌肽的分离纯化[J].微生物学报，2004，44（4）：511-514.
[14] 沈锦玉，尹文林，曹铮，等.枯草芽孢杆菌 B115 抗菌蛋白的分离纯化及部分性质[J].水生生物学报，2005，29（6）：689-693.
[15] 郭荣君，王步云，李世东.营养对生防菌株BH1芽孢产量的影响研究[J].植物病理学报，2005，35（3）：283-285.
[16] 林运萍，谭志琼，张荣意.香蕉冠腐病拮抗细菌 B68 的发酵条件[J].热带作物学报，2006，27（2）：81-85.
[17] 权春善，王军华，范圣第，等.一株抗真菌解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件的初步研究[J].微生物学报，2006，46（1）：7-12.
[18] 赵丽华.枯草芽孢杆菌拮抗菌株B29活性物质形成条件研究及其抗菌蛋白的分离纯[D].哈尔滨：黑龙江大学，2007.
关键词 枯草芽孢杆菌；培养条件；酶活性检测
中图分类号 S482.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）35-12505-03
芽孢杆菌作为植物病害生防菌的研究越来越多，涉及的防治对象包括叶部、根部等多种气传、土传植物病害。芽孢杆菌对环境无污染，具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力[1]。其芽孢可以制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型或与化学农药混用而不失活。随着“绿色植保” 和“公共植保”观念的增强，枯草芽孢杆菌作为生物防治的潜在优势备受关注。近年来，国内外学者就枯草芽孢杆菌防治植物病害方面进行了大量研究，并已开发出多种商品化菌剂应用于农业生产[2-4]。枯草芽孢杆菌BS11是海南省热带生物资源可持续利用重点实验室分离的对香蕉枯萎病、橡胶炭疽、芒果炭疽、辣椒炭疽、橡胶棒孢等有较好抑制作用的拮抗菌，笔者对其抗真菌活性物质进行了初步研究，旨在为该菌株的进一步研究与开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株。
枯草芽孢杆菌BS11由海南省热带生物资源可持续利用重点实验室分离，指示菌香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌、橡胶炭疽病菌、芒果炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、橡胶棒孢病菌均由该实验室保存。
1.1.2 培养基。
PDA 培养基、NB培养基、LB培养基、蛋白酶培养基、几丁质培养基、羧甲基纤维素培养基均按文献所述方法配制[5-8]。
1.2 方法
1.2.1 抑菌效果的测定。采用琼脂孔扩散对峙法[9]。
将香蕉枯萎病病菌菌饼（ф=8 mm）接种于 PDA 平板中央，在菌饼周围 2 cm 处均匀打 4个孔（ф=8 mm），将待测物注入孔内，每孔40 μl，将平板置于密封的塑料袋于28 ℃培养2～4 d，观察到有抑菌圈出现为止。测量抑菌带宽度，以抑菌带宽度大小评价抑菌效果。
1.2.2 NB和LB培养基中的生长曲线及其上清液的抑菌活性。
将种子菌悬液以2%转接于NB和LB液体发酵培养基（250 ml摇瓶装液量60 ml），28 ℃、200 r/min 条件下振荡培养，于不同的时间取出小份样品分别测其A600值和抑菌活性。
1.2.3 抑菌活性物质的粗提[10-14]。
1.2.3.1 硫酸铵沉淀法。
在无菌活性上清液中加入硫酸铵至饱和度70%，4 ℃静置过夜。4 ℃、10 000 r/min离心20 min，收集沉淀，将沉淀用1/15的磷酸盐缓冲液（pH 6.8、0.02 mol/L）溶解，透析脱盐即得粗提液，测其抑菌活性。
1.2.3.2 乙醇沉淀法。
在无菌活性上清液中加入3倍体积的95%乙醇，使乙醇的终浓度为70%，4 ℃静置过夜沉淀。4 ℃、10 000 r/min离心20 min，干燥后用少量磷酸盐缓冲液（pH 6.8、0.02 mol/L）溶解，测其抑菌活性。
1.2.3.3 乙酸乙酯萃取。在无菌活性上清液中加入等体积的乙酸乙酯于分液漏斗振荡混匀，过夜，收集乙酸乙酯层，水温50 ℃真空旋转浓缩至体积不再变化，用少量甲醇洗出，加蒸馏水调至甲醇浓度为10%，调pH为7.0，用稀释液做活性测定，以无菌水和10%甲醇水溶液作对照。
1.2.4 培养条件对BS11菌株产生抑菌活性物质的影响[15-17]。
1.2.4.1 培养基初始pH对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
用HCl和NaOH溶液将培养液pH分别调至4、5、6、7、8、9，在250 ml三角瓶中分别装入100 ml培养基，将种子液以2%的比例接入到培养基中，于30 ℃振荡培养48 h。
1.2.4.2 培养温度对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
在250 ml三角瓶中分别装入100 ml培养基，将种子液以2%的比例接入到培养基中，于28、30、32、34、36 ℃振荡培养48 h。
1.2.4.3 不同装液量对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
在250 ml三角瓶中分别装入20、40、60、80、100 ml培养基，将种子液以2%的比例接入到培养基中，于30 ℃振荡培养48 h。
1.2.5 活性上清液的蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶的检测。
1.2.5.1 蛋白酶活性检测[6]。
在蛋白酶培养基上打孔，将活性上清液注入孔中，28 ℃ 培养2 d，观察孔周围是否产生透明圈。
1.2.5.2 纤维素酶（β-1，4-葡聚糖酶）活性检测[8]。
在羧甲基纤维素培养基上打孔，将活性上清液注入孔中，28 ℃ 培养2 d，用 1 mg/ml 刚果红染色 20 min，再用 1 mol/L NaCl浸泡15 min，用水洗去表面附着的刚果红，观察孔周围是否产生透明圈。 1.2.5.3 几丁质酶活性检测[7]。
在几丁质培养基上打孔，将活性上清液注入孔中，28 ℃ 培养 2 d，用 1 mg/ml 刚果红染色 20 min，再用1 mol/L NaCl 浸泡15 min，用水洗去表面附着的刚果红，观察孔周围是否产生透明圈。
2 结果与分析
2.1 枯草芽孢杆菌BS11的抑菌活性 用平板对峙试验对枯草芽孢杆菌BS11菌株对芒果炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、橡胶炭疽病菌、橡胶棒孢病菌进行了初步研究，发现其对以上4种常见的植物真菌病害都有较好的抑制作用（图1）。
2.2 LB和NB培养基中生长曲线以及抑菌物质的活性测定
由图2可知，拮抗菌BS11在LB培养基上生长繁殖速度快，但抑菌活性很差；在NB培养基上生长繁殖速度相对较慢，抑菌活性却相对较好，表明活性物质的产量与菌量不成正比。
2.3 抑菌活性物质的粗提
将枯草芽孢杆菌BS11菌株的培养上清液经0.22 μm的微孔滤膜过滤后，分别用乙醇、乙酸乙酯和硫酸铵沉淀后，发现乙醇沉淀和乙酸乙酯萃取物均不能检测到抑菌活性，而硫酸铵沉淀法则能检测到较好的抑菌活性（图3），说明硫酸铵沉淀法基本上可将活性物质提取出来，该活性物质有可能是蛋白质。
2.4 培养条件对BS11菌株产生抑菌活性物质的影响
2.4.1 培养基初始pH对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
以NB为培养基，初始pH为4时拮抗菌BS11不生长，pH为7时抑菌活性最好，偏酸偏碱都不利于活性物质的生成，相比较而言碱性条件下更不利于活性物质的生成（图4）。
2.4.2 培养温度对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
在微生物的培养温度中，有最高、最适与最低培养温度之分，而最适培养温度则是其分裂一代所需的最短时间的培养温度，不同的微生物生长繁殖所需的最适温度也是各异的。由图5可知，30 ℃时拮抗菌BS11抑菌活性最好。
2.4.3 不同装液量对BS11菌株产生抗菌物质的影响。
在NB中拮抗菌BS11最适的装液量为60 ml，枯草芽孢杆菌是好氧性细菌，摇瓶中的氧气量将直接影响细菌的生长和活性物质的产生。试验结果表明，250 ml 三角瓶中装入 60 ml 的培养液最适于抗菌蛋白的产生，随着装液量增加，瓶中空气量减少，菌体生长受到影响，活性物质产量减小，装液量过少，活性物质产量也少（图6）。
2.5 活性粗提液的蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶活性的检测
2.5.1 蛋白酶活性检测。
在蛋白酶培养基琼脂孔周围中有透明圈产生（图7），说明发酵液中含有能够分解蛋白的酶。
2.5.2 纤维素酶活性检测。在羧甲基纤维素培养基琼脂孔周围中有透明圈产生（图8），说明发酵液中含有能够分解羧甲基纤维素的蛋白酶。
2.5.3 几丁质酶活性检测。发酵液中未能检测到能够分解几丁质的酶。
3 结论与讨论
枯草芽孢杆菌BS11菌株在LB培养基中很快就进行大量繁殖，生长良好但是抑菌活性却很低，NB培养基与LB培养基相比生长繁殖速度较慢而抑菌活性较好。由此可见，拮抗菌活性物质的产生与菌体生长繁殖速度不成正比关系。在LB培养基中检测到的活性物质活性较低，可能是由于该活性物质属于诱导表达[18]，而LB培养基中没有诱导该活性物质表达所需的元素，也可能是LB培养基中有抑制活性物质表达的成分。乙醇沉淀法和乙酸乙酯萃取法都不能将活性物质提取出来，而硫酸铵沉淀法可以将活性物质提取出来，初步判断枯草芽孢杆菌BS11菌株所产生的活性物质有可能不是化学化合物而是蛋白质类物质。对枯草芽孢杆菌BS11菌株培养上清中与抗菌活性有关的蛋白酶、纤维素酶以及几丁质酶活性进行检测，发现具有抗菌活性的上清中有蛋白酶活性和纤维素酶活性无几丁质酶活性，可以排除抗真菌活性物质是几丁质酶的可能。该试验通过对香蕉枯萎病拮抗菌株BS11抗真菌活性物质的研究，发现该活性物质具有广谱的抗真菌活性、性质稳定、易提取等特点，具有潜在的商业化应用价值。
参考文献
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