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摘要：为给水生植物芡实（Euryale ferox）生物肥料的研制提供优良的菌株资源，采用保绿法和萝卜子叶增重法从芡实根际土壤筛选出2株作用效果较好的细菌Q6-2和Q67，用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）定量分析菌株产植物激素和有机酸的能力；通过盆栽试验研究2株细菌对苗期芡实的促生作用；结合生理生化试验和16S rDNA序列分析对2株细菌进行鉴定。结果显示，2株细菌均能够产生玉米素、激动素等植物激素和少量有机酸，Q6-2还能够产生吲哚乙酸；接种Q6-2后，芡实幼苗茎长、叶片数、最大叶面积、生物量（干重）分别比对照高出18.85%、40.67%、76.28%和37.50%，接种Q67的处理各项指标分别比对照高出27.47%、42.81%、96.05%和42.97%，差异显著；接种Q6-2和Q67后，叶绿素含量分别高出对照43.27%和51.46%，根系活力则分别高出5.41%和7.05%，差异显著。经鉴定，Q6-2和Q67均为地衣芽孢杆菌，GenBank登录号分别为KP686129和KP686133。2株细菌有效促进了芡实幼苗生长发育水平，在微生物肥料的生产中具有广阔的应用前景。
关键词：芡实；植物根际促生菌；植物激素；促生；鉴定
中图分类号：S154.38+1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）08-0053-06
Abstract This study aims to provide excellent bacterial strain resources for the production of Euryale ferox bio-fertilizer. Two strains with relatively higher performance named Q6-2 and Q67 were screened from the rhizosphere soil of Euryale ferox using the methods of remaining green and radish cotyledon bioassay； their production capability of plant hormones and organic acids were quantitatively analyzed by HPLC； their promotion effects on the growth of Euryale ferox at seedling stage were investigated by pot experiments； also， they were identified by physiological and biochemical experiments and 16S rDNA sequence analysis. The results indicated that the two strains were both able to produce zeatin， kinetin and small amount of organic acid. Q6-2 was also able to produce indoleacetic acid （IAA）. After inoculated by Q6-2， the growth parameters of Euryale ferox seedlings， such as stem length， number of leaves， maximum leaf area and biomass （dry weight）， significantly increased by 18.85%， 40.67%， 76.28% and 37.50% respectively compared to the control； while inoculated by Q67， the above mentioned indexes significantly increased by 27.47%， 42.81%， 96.05% and 42.97% respectively. After inoculated by Q6-2 and Q67， the chlorophyll content increased by 43.27% and 51.46% respectively， and the root activity increased by 5.41% and 7.05% respectively， showing significant differences compared to the control. Q6-2 and Q67 were both identified as Bacillus licheniformis， whose GenBank accession number were KP686129 and KP686133 respectively. In conclusion， the two strains were able to promote the growth and development of Euryale ferox seedlings efficiently， showing great application prospect in the production of microbial fertilizer.
Key words Euryale ferox； Plant growth-promoting rhizobacteria； Plant hormones； Growth promoting； Identification 芡实（Euryale ferox）又名芡、鸡头等，睡莲科芡属一年生大型草本水生植物，是我国极具代表性的水生蔬菜品种，其生产历史悠久，广泛分布于我国南北各省[1]。芡实种仁（干芡米）含有丰富的蛋白质、碳水化合物、维生素及微量元素等，具有较高的营养及药用价值，市场前景广阔[2]。近年来，我国江淮一带芡实种植面积不断加大，种植过程中多采用化学肥料和农药，虽能在一定程度上保证芡实产量，但长期以往极易造成土壤质量下降，引起农药残留等问题。随着人们环保意识的增强和对食品安全的重视，开发新型微生物肥料已成为芡实种植可持续发展的重要方向。
微生物肥料是由有益活体微生物接种到吸附载体中制成的，利用微生物的代谢过程或代谢产物促进植物生长[3，4]。选育性能优良的菌株是研制微生物肥料的核心环节。植物根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria， PGPR）是指一群定殖于植物根际、与植物根系密切相关的有益细菌，它们可以通过产生植物激素、拮抗病原菌、诱导系统抗性（ISR）、溶磷、解钾等多种方式直接或间接促进作物生长[5，6]。因此，利用PGPR研制微生物肥料能够有效降低化肥和农药的用量，对芡实的无公害种植具有重要作用。
目前，国内外已发现包括芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）、产碱菌属（Alcaligens）、固氮菌属（Azotobacter）等20多个种属的细菌具有防病促生潜能[7]，但大多数PGPR均分离自陆生植物根际，尚未有关于芡实等水生植物方面的报道。水生植物的根际环境、根系发育、形态学方面较为特殊[8，9]，其根际细菌的种类和特征较陆生植物也可能存在一些不同。针对上述特点，本研究从芡实根际土壤筛选具有良好促生作用的菌株，并对产植物激素等生物学特性加以分析，初步探讨了其对苗期芡实生长发育的影响，以期为芡实微生物肥料的研制奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 试剂及培养基
色谱分析中用到的甲醇等流动相、植物激素标准品等购自国药集团；有机酸标准品为国产优级纯；分子生物学试剂购自于全式金生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。细菌的分离、培养及发酵液的制备用NA培养基，细菌保藏用LB 培养基。
1.2 土壤样品及根际细菌的分离
从苏州市甪直镇芡实种植地采集8个土壤样品，梯度稀释后涂布于NA平板，为模拟水田的少氧环境，待稀释液完全渗入培养基后，在表面倾注一层尽量厚的水琼脂。30℃培养48 h后，挑取不同形态细菌分离物，采用穿刺法接种于装有半固体NA培养基的试管底部，并灌注约1 cm厚的无菌石蜡，筛选兼性厌氧菌。从试管底部挑取生长速度较快的细菌分离物，采用三区划线法对其反复纯化，将纯化后菌株编号并保存于LB斜面，备用。
1.3 保绿法初筛[10]
1.3.1 小麦幼苗培养 选取颗粒饱满、大小一致的小麦种子，表面消毒后用无菌水冲洗数次，吸干表面水分后播种于垫有双层滤纸的培养皿中，加盖后置于23℃培养箱中避光培养。24～36 h后，保留发芽整齐的种子继续培养。当麦芽顶到皿盖时，摘去皿盖，光照继续培养，每日光照时间约为14 h，培养过程中随时补充蒸发的水分。
1.3.2 细菌发酵液制备 取数支18 mm×180 mm的试管，接入约5 mL液体NA培养基，1×105 Pa灭菌30 min。将筛选到的根际细菌活化，分别接种于上述试管中，30℃、180 r/min条件下摇床培养24 h，制备发酵液，备用。
1.3.3 发酵液保绿效果分析 将每管细菌发酵液中加入5 mL无菌水，混匀待用。另取一支装有培养基但不接菌的试管，加入等量无菌水作为对照。待小麦叶片长至约10 cm高时，将其取出切成约1 cm的小段，装入各细菌发酵稀释液试管中，每管5段。 25℃暗室放置4 d后，根据叶片颜色目测保绿情况。每菌株重复3次。
1.4 萝卜子叶增重法复筛
萝卜幼苗的培养同1.3.1。将经保绿法初筛后的菌株接入装有50 mL NA培养基的三角瓶，30℃、180 r/min摇床培养24 h。将发酵液以3 000 r/min离心20 min，转移30 mL上清液至无菌三角瓶，加入等量的无菌水稀释，待用，另取空白培养基用无菌水等量稀释作为对照[11]。萝卜子叶充分展开后，剪下较小的1片子叶，称重并装入垫有两张滤纸的培养皿中，每皿摆放8片，用已稀释好的上清菌液浇灌，加盖后置于25℃培养箱光照培养4 d，每日补充蒸发的稀释上清菌液。4 d后取出子叶，用无菌水冲洗，吸干表面水分后称重，分析菌株对萝卜子叶的促生作用[12]。每处理重复3次，保留促生效果较好的菌株备用。
1.5 发酵液中植物激素及有机酸测定
通过高效液相色谱法（HPLC）测定复筛后的PGPR菌株分泌赤霉素（Gibberellin， GA）、玉米素（Zeatin， ZT）、激动素（Kinetin， KT）和脱落酸（Abscisic acid， ABA）等植物激素的情况。菌株发酵液的制备同1.3.2，发酵液 5 000 r/min 离心10 min去除菌体碎片，上清液再经0.22 μm滤膜过滤，即为HPLC上机样品。色谱条件参照陈波等[10]的方法，略有改动，色谱柱：Gemini5u-C18-110A （4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相：甲醇∶1%冰醋酸=40∶60（体积比）；梯度流速：0.01～12.00 min为0.8 mL/min，12.01～25.00 min为1.0 mL/min；检测波长254 nm，柱温37°C，进样量10 μL。
吲哚乙酸（IAA）的测定参照文献[13]。 采用HPLC法测定甲酸、乙酸、草酸、丙酸、丙二酸、丁二酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸等10种有机酸的含量。发酵液的制备同1.3.2，取10 mL发酵液定容于100 mL容量瓶中，用流动相稀释并定容，过0.22 μm滤膜，滤液即为上机样品。色谱柱同上，流速为1 mL/min；流动相：97%的K2HPO4 （用 pH 2.55磷酸调配成0.01 mol/L），3%的甲醇；检测波长210 nm，柱温30℃，进样量20 μL。
1.6 菌株对苗期芡实的促生作用盆栽试验
芡实种子由苏州澄湖现代科技生态农业发展有限责任公司提供，种子浸泡露白后，播种至直径约40 cm的塑料盆育苗，保持5～10 cm的水位，不断补充水分培养至3～4片真叶，备用。盆栽用土取自深圳本地公园池塘底泥，土壤碱解氮含量33.85 mg/kg，速效磷含量28.42 mg/kg，速效钾含量120.12 mg/kg，有机质含量为21.83 g/kg，腐殖质含量为11.26 g/kg，pH 7.33。
试验设在深圳清华大学研究院顶楼日光温室，共设计3个处理，处理1：对照（CK），施加等量空白培养基；处理2：接种促生菌Q6-2发酵液；处理3：接种促生菌Q67发酵液。发酵液的制备同1.3.2，用无菌水将浓度调节至约108 CFU/mL。试验采用直径约50 cm、深度约40 cm的塑料桶，每桶装塘泥约5 kg（干重）并加适量清水，放置2～3 d使塘泥刚好处于松软稀松的状态，分别接种各菌株的发酵液，每盆浇施约15 mL。平衡3 d后加入清水，水位高约10 cm，继续平衡4 d，取长势一致的芡实幼苗移栽，每盆5株。每处理3个重复。随植株生长逐步加深水深，以利叶柄伸长，培养期为40 d。
40 d后，测定芡实的茎长、叶片数量、叶面积等农艺性状及叶绿素、根系活力等指标[14]，同时取出植株用清水洗净，分为地上与地下两部分，风干后将植株置于烘箱中105℃杀青30 min，60℃继续烘干48 h，测定干重。
1.7 菌株鉴定
生理生化试验参照东秀珠等[15]的方法。提取菌株的基因组DNA，采用16S rDNA通用引物27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1495R （5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）扩增其16S rDNA序列。PCR反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 50 s，56℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30个循环；72℃ 10 min。PCR产物由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果提交GenBank并构建系统发育树。
1.8 数据统计及分析
采用SPSS 18.0和ORIGIN 8.6软件对数据进行计算、整理；采用新复极差法，在0.05水平上分析差异显著性（P<0.05）。菌株16S rDNA序列通过DNAMAN 7.02和NCBI中的BLAST分析，用MEGA 6程序Neighbor-joining算法构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 芡实根际促生细菌的筛选
通过梯度稀释法涂布平板，加盖琼脂层模拟少氧环境，从芡实根际土壤共分离得到236个细菌分离物，经穿刺接种法反复筛选并纯化，得到17株能够快速生长的细菌。通过保绿法对这17株细菌进行初筛，共有Q6-2、Q11、Q67等10株细菌对小麦叶片的保绿效果较好。采用萝卜子叶增重法进一步验证其促生效果（表1），结果显示，接种菌株Q6-2和Q67的萝卜子叶增重率超过了300%，与对照相比，2株细菌对萝卜子叶的增重率分别提高59.26%和70.94%，具有良好的促生潜力。
2.2 菌株产植物激素及有机酸情况
产生植物激素刺激植物生长是PGPR重要的促生机制之一[16]，分泌植物激素含量的多少，是判定其促生效果强弱的重要指标。本文通过HPLC法定量检测了PGPR菌株Q6-2和Q67发酵液中植物激素的含量（表2）。结果显示，2株细菌均能够产生细胞分裂素ZT和KT，总量分别为4.36 mg/L和5.51 mg/L；菌株Q6-2还能够分泌生长素IAA；2株细菌发酵液中均未检测到GA和ABA。
某些细菌在代谢过程中会分泌有机酸，促进土壤难溶的磷、钾化合物的溶解，供给植物可以利用的营养成分[17]。有机酸HPLC测定结果显示，甲酸、乙酸、草酸、丙酸、丙二酸、柠檬酸和乳酸标准品分别在3.55、4.89、3.13、10.10、4.38、6.45、4.65 min出现吸收峰，丁二酸在7.21、8.28 min出现2个吸收峰，酒石酸在3.42、9.39 min出现2个吸收峰，苹果酸在4.06、8.20、7.38 min时出现3个吸收峰。根据出峰时间和峰形初步判断Q6-2发酵液中含有乳酸、丙酸、柠檬酸3种有机酸；Q67发酵液中含有甲酸、乳酸、丙酸和丁二酸4种有机酸。
2.3 PGPR对苗期芡实生长发育影响
芡实幼苗移栽40 d后，测定农艺性状及生物量等各项指标（表3）。结果显示，接种Q6-2后，芡实幼苗茎长、单株叶片数、最大叶面积、生物量（干重）分别比对照高出18.85%、40.67%、76.28%和37.50%，差异显著；接种Q67的芡实幼苗以上指标分别比对照高出27.47%、42.81%、96.05%和42.97%，差异显著。可见，根际细菌Q6-2和Q67对芡实幼苗的生长发育具有一定促进作用，Q67的促进效果略好于Q6-2，但二者间差异不显著。
2.4 PGPR对苗期芡实叶绿素及根系发育的影响
叶绿素含量和根系发育水平是判断植物生长发育水平的重要指标。移栽40 d后，对各处理芡实幼苗叶片的叶绿素含量以及根部干重、根冠比、根系活力等指标进行测定（表4）。结果表明，2株PGPR均有利于苗期芡实叶片中叶绿素的合成，接种Q6-2和Q67的处理叶片叶绿素含量分别比对照高出43.27%和51.46%，差异显著。此外， PGPR也促进了芡实幼苗根系的发育水平，接种Q6-2后，芡实幼苗的根部干重、根冠比和根系活力分别比对照高出52.50%、15.22%和5.41%；而接种Q67的处理，以上指标分别比对照高62.50%、21.74%和7.05%，根部干重和根系活力与对照间差异显著。Q67的促生效果略好Q6-2，但二者间差异不显著。 2.5 菌株鉴定
2.5.1 菌株形态特征及理化特性分析 Q6-2在NA培养基上生长24～48 h后，菌落呈白色，表面粗糙，非常干燥，不透明，边缘小锯齿状，中间点状突起，有褶皱，直径2～4 mm；镜检（1 000倍）菌体呈杆状，（1.5～3.0） μm×（0.6～0.8） μm，单生或集群，芽孢中生。Q67大部分形态特征与Q6-2相同，平板菌落一段时间后产生红色素，菌落直径3～5 mm，镜检下菌体大小约为（1.8～3.3） μm×（0.5～0.9） μm。
Q6-2的部分生理生化特性为：革兰氏阳性；接触酶、V-P试验、硝酸盐还原、淀粉水解、明胶液化阳性；M.R、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚试验阴性；葡萄糖产酸不产气；7% NaCl下可生长；生长温度为20～55℃。Q67大部分生理生化特性与Q6-2相同，只有M.R试验为阳性，生长温度范围15～55℃。
2.5.2 菌株的 16S rDNA序列分析 采用通用引物对菌株Q6-2和Q67的基因组DNA进行扩增，得到约1 440 bp的扩增片段，将序列提交 GenBank，获得登录号分别为KP686129和KP686133。将序列进行BLAST分析，选取相近种属的细菌构建系统发育树。结果如图1所示，2株细菌与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）下几株地衣芽孢杆菌聚为同一类群，Q6-2与Bacillus licheniformis CGMCC 2876 （GQ148817）和Bacillus licheniformis CICC 10181 （AY842871）的相似度均达到了97%；Q67与图中其余4株地衣芽孢杆菌的相似度均为99%。结合形态特征、理化特性及16S rDNA序列分析，将2株细菌鉴定为地衣芽孢杆菌。
3 讨论与结论
已有大量研究表明，接种PGPR能够促进植物生长、提高产量，如：Kumar等[18]通过浸种的方式接种Pseudomonas aeruginosa LES4，有效提高了芝麻产量，出油率和蛋白质含量比对照高出33.3%和47.5%；常文智等[19]接种Paenibacillus mucilaginosus 3016，将花生总产量提高了10.4%。也有研究表明，相比于从其他环境分离到的菌株，从某种植物根际筛选到PGPR菌株具有更好的环境适应性，可能对该种植物具有更好的应用效果[20]。由于水生植物根系环境与陆生植物差异较大，目前尚未有关于水生植物PGPR方面的报道，因此从芡实根际土壤有针对性地筛选促生细菌，是芡实微生物肥料研制过程中的关键环节。本文通过平板覆盖琼脂、穿刺法等模拟水田的少氧环境，从芡实根际土壤分离到17株在少氧条件下可以良好生长的细菌，并通过保绿法和萝卜子叶增重法进一步筛选到2株能够产生植物激素PGPR菌株Q6-2和Q67，经鉴定，2株细菌均为地衣芽孢杆菌。
研究表明，通过产生植物激素调节植物生长，是PGPR重要的促生机制之一[20]。HPLC结果显示，芡实根际细菌Q6-2和Q67能够产生ZT和KT，Q6-2还可以分泌IAA。ZT和KT是2种常见的细胞分裂素，不仅能够延缓叶片衰老，而且对植物生长具有促进作用[21，22]；IAA是一种生长素，一定浓度水平上可促进植物生根及地上部分的壮大[23]。与其他类似的研究相比，Q6-2和Q67产细胞分裂素的能力（4.36 mg/L和5.51 mg/L）高于Hussain等[24]筛选到的菌株Am3 （0.42 mg/L），Q6-2还能产生IAA，但产量低于陈波等[10]分离到的菌株AI5和PII17，2株细菌均不产生GA和ABA。试验中发现，2株细菌能分泌不同种类的有机酸，在促进土壤中难溶的磷、钾等化合物方面展现出一定的潜力。
盆栽试验结果表明，接菌处理幼苗的茎长、叶数、最大叶面积和生物量等指标全面优于对照，增长幅度在18.85%～96.05%之间。接种Q6-2和Q67也促进了幼苗叶绿素的合成和根系发育水平，其中叶绿素是反应植物光合作用强弱的重要指标，而苗期作物的根系发育对地上部分生长和后期发育起到至关重要的作用[25]，可见，2株细菌在促生方面展现出了良好的应用潜力，也可能存在着诱导植株系统抗性（ISR）的作用。虽然Q6-2和Q67同为地衣芽孢杆菌，但无论是农艺性状还是生理指标方面，Q67的作用效果均要好于Q6-2，这可能是由于2株细菌代谢产物不同造成的。
地衣芽孢杆菌在防病、促生方面的作用早有报道[26，27]，本研究首次探讨了其对水生作物的促生作用。地衣芽孢杆菌是一种兼性厌氧芽孢杆菌，相比于其他PGPR菌株，更适用于水田环境。因此，PGPR菌株Q6-2和Q67在开发芡实等水生作物微生物肥料方面具有巨大的应用潜力。由于细菌生长受到温度、水分、土壤理化性质等外界环境的影响较大，本研究的效果还有待在大田条件下加以验证，有关2株细菌的促生机制、产酶情况以及在芡实根际的定殖情况等也需要进一步研究。
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关键词：芡实；植物根际促生菌；植物激素；促生；鉴定
中图分类号：S154.38+1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）08-0053-06
Abstract This study aims to provide excellent bacterial strain resources for the production of Euryale ferox bio-fertilizer. Two strains with relatively higher performance named Q6-2 and Q67 were screened from the rhizosphere soil of Euryale ferox using the methods of remaining green and radish cotyledon bioassay； their production capability of plant hormones and organic acids were quantitatively analyzed by HPLC； their promotion effects on the growth of Euryale ferox at seedling stage were investigated by pot experiments； also， they were identified by physiological and biochemical experiments and 16S rDNA sequence analysis. The results indicated that the two strains were both able to produce zeatin， kinetin and small amount of organic acid. Q6-2 was also able to produce indoleacetic acid （IAA）. After inoculated by Q6-2， the growth parameters of Euryale ferox seedlings， such as stem length， number of leaves， maximum leaf area and biomass （dry weight）， significantly increased by 18.85%， 40.67%， 76.28% and 37.50% respectively compared to the control； while inoculated by Q67， the above mentioned indexes significantly increased by 27.47%， 42.81%， 96.05% and 42.97% respectively. After inoculated by Q6-2 and Q67， the chlorophyll content increased by 43.27% and 51.46% respectively， and the root activity increased by 5.41% and 7.05% respectively， showing significant differences compared to the control. Q6-2 and Q67 were both identified as Bacillus licheniformis， whose GenBank accession number were KP686129 and KP686133 respectively. In conclusion， the two strains were able to promote the growth and development of Euryale ferox seedlings efficiently， showing great application prospect in the production of microbial fertilizer.
Key words Euryale ferox； Plant growth-promoting rhizobacteria； Plant hormones； Growth promoting； Identification 芡实（Euryale ferox）又名芡、鸡头等，睡莲科芡属一年生大型草本水生植物，是我国极具代表性的水生蔬菜品种，其生产历史悠久，广泛分布于我国南北各省[1]。芡实种仁（干芡米）含有丰富的蛋白质、碳水化合物、维生素及微量元素等，具有较高的营养及药用价值，市场前景广阔[2]。近年来，我国江淮一带芡实种植面积不断加大，种植过程中多采用化学肥料和农药，虽能在一定程度上保证芡实产量，但长期以往极易造成土壤质量下降，引起农药残留等问题。随着人们环保意识的增强和对食品安全的重视，开发新型微生物肥料已成为芡实种植可持续发展的重要方向。
微生物肥料是由有益活体微生物接种到吸附载体中制成的，利用微生物的代谢过程或代谢产物促进植物生长[3，4]。选育性能优良的菌株是研制微生物肥料的核心环节。植物根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria， PGPR）是指一群定殖于植物根际、与植物根系密切相关的有益细菌，它们可以通过产生植物激素、拮抗病原菌、诱导系统抗性（ISR）、溶磷、解钾等多种方式直接或间接促进作物生长[5，6]。因此，利用PGPR研制微生物肥料能够有效降低化肥和农药的用量，对芡实的无公害种植具有重要作用。
目前，国内外已发现包括芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）、产碱菌属（Alcaligens）、固氮菌属（Azotobacter）等20多个种属的细菌具有防病促生潜能[7]，但大多数PGPR均分离自陆生植物根际，尚未有关于芡实等水生植物方面的报道。水生植物的根际环境、根系发育、形态学方面较为特殊[8，9]，其根际细菌的种类和特征较陆生植物也可能存在一些不同。针对上述特点，本研究从芡实根际土壤筛选具有良好促生作用的菌株，并对产植物激素等生物学特性加以分析，初步探讨了其对苗期芡实生长发育的影响，以期为芡实微生物肥料的研制奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 试剂及培养基
色谱分析中用到的甲醇等流动相、植物激素标准品等购自国药集团；有机酸标准品为国产优级纯；分子生物学试剂购自于全式金生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。细菌的分离、培养及发酵液的制备用NA培养基，细菌保藏用LB 培养基。
1.2 土壤样品及根际细菌的分离
从苏州市甪直镇芡实种植地采集8个土壤样品，梯度稀释后涂布于NA平板，为模拟水田的少氧环境，待稀释液完全渗入培养基后，在表面倾注一层尽量厚的水琼脂。30℃培养48 h后，挑取不同形态细菌分离物，采用穿刺法接种于装有半固体NA培养基的试管底部，并灌注约1 cm厚的无菌石蜡，筛选兼性厌氧菌。从试管底部挑取生长速度较快的细菌分离物，采用三区划线法对其反复纯化，将纯化后菌株编号并保存于LB斜面，备用。
1.3 保绿法初筛[10]
1.3.1 小麦幼苗培养 选取颗粒饱满、大小一致的小麦种子，表面消毒后用无菌水冲洗数次，吸干表面水分后播种于垫有双层滤纸的培养皿中，加盖后置于23℃培养箱中避光培养。24～36 h后，保留发芽整齐的种子继续培养。当麦芽顶到皿盖时，摘去皿盖，光照继续培养，每日光照时间约为14 h，培养过程中随时补充蒸发的水分。
1.3.2 细菌发酵液制备 取数支18 mm×180 mm的试管，接入约5 mL液体NA培养基，1×105 Pa灭菌30 min。将筛选到的根际细菌活化，分别接种于上述试管中，30℃、180 r/min条件下摇床培养24 h，制备发酵液，备用。
1.3.3 发酵液保绿效果分析 将每管细菌发酵液中加入5 mL无菌水，混匀待用。另取一支装有培养基但不接菌的试管，加入等量无菌水作为对照。待小麦叶片长至约10 cm高时，将其取出切成约1 cm的小段，装入各细菌发酵稀释液试管中，每管5段。 25℃暗室放置4 d后，根据叶片颜色目测保绿情况。每菌株重复3次。
1.4 萝卜子叶增重法复筛
萝卜幼苗的培养同1.3.1。将经保绿法初筛后的菌株接入装有50 mL NA培养基的三角瓶，30℃、180 r/min摇床培养24 h。将发酵液以3 000 r/min离心20 min，转移30 mL上清液至无菌三角瓶，加入等量的无菌水稀释，待用，另取空白培养基用无菌水等量稀释作为对照[11]。萝卜子叶充分展开后，剪下较小的1片子叶，称重并装入垫有两张滤纸的培养皿中，每皿摆放8片，用已稀释好的上清菌液浇灌，加盖后置于25℃培养箱光照培养4 d，每日补充蒸发的稀释上清菌液。4 d后取出子叶，用无菌水冲洗，吸干表面水分后称重，分析菌株对萝卜子叶的促生作用[12]。每处理重复3次，保留促生效果较好的菌株备用。
1.5 发酵液中植物激素及有机酸测定
通过高效液相色谱法（HPLC）测定复筛后的PGPR菌株分泌赤霉素（Gibberellin， GA）、玉米素（Zeatin， ZT）、激动素（Kinetin， KT）和脱落酸（Abscisic acid， ABA）等植物激素的情况。菌株发酵液的制备同1.3.2，发酵液 5 000 r/min 离心10 min去除菌体碎片，上清液再经0.22 μm滤膜过滤，即为HPLC上机样品。色谱条件参照陈波等[10]的方法，略有改动，色谱柱：Gemini5u-C18-110A （4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相：甲醇∶1%冰醋酸=40∶60（体积比）；梯度流速：0.01～12.00 min为0.8 mL/min，12.01～25.00 min为1.0 mL/min；检测波长254 nm，柱温37°C，进样量10 μL。
吲哚乙酸（IAA）的测定参照文献[13]。 采用HPLC法测定甲酸、乙酸、草酸、丙酸、丙二酸、丁二酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸等10种有机酸的含量。发酵液的制备同1.3.2，取10 mL发酵液定容于100 mL容量瓶中，用流动相稀释并定容，过0.22 μm滤膜，滤液即为上机样品。色谱柱同上，流速为1 mL/min；流动相：97%的K2HPO4 （用 pH 2.55磷酸调配成0.01 mol/L），3%的甲醇；检测波长210 nm，柱温30℃，进样量20 μL。
1.6 菌株对苗期芡实的促生作用盆栽试验
芡实种子由苏州澄湖现代科技生态农业发展有限责任公司提供，种子浸泡露白后，播种至直径约40 cm的塑料盆育苗，保持5～10 cm的水位，不断补充水分培养至3～4片真叶，备用。盆栽用土取自深圳本地公园池塘底泥，土壤碱解氮含量33.85 mg/kg，速效磷含量28.42 mg/kg，速效钾含量120.12 mg/kg，有机质含量为21.83 g/kg，腐殖质含量为11.26 g/kg，pH 7.33。
试验设在深圳清华大学研究院顶楼日光温室，共设计3个处理，处理1：对照（CK），施加等量空白培养基；处理2：接种促生菌Q6-2发酵液；处理3：接种促生菌Q67发酵液。发酵液的制备同1.3.2，用无菌水将浓度调节至约108 CFU/mL。试验采用直径约50 cm、深度约40 cm的塑料桶，每桶装塘泥约5 kg（干重）并加适量清水，放置2～3 d使塘泥刚好处于松软稀松的状态，分别接种各菌株的发酵液，每盆浇施约15 mL。平衡3 d后加入清水，水位高约10 cm，继续平衡4 d，取长势一致的芡实幼苗移栽，每盆5株。每处理3个重复。随植株生长逐步加深水深，以利叶柄伸长，培养期为40 d。
40 d后，测定芡实的茎长、叶片数量、叶面积等农艺性状及叶绿素、根系活力等指标[14]，同时取出植株用清水洗净，分为地上与地下两部分，风干后将植株置于烘箱中105℃杀青30 min，60℃继续烘干48 h，测定干重。
1.7 菌株鉴定
生理生化试验参照东秀珠等[15]的方法。提取菌株的基因组DNA，采用16S rDNA通用引物27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1495R （5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）扩增其16S rDNA序列。PCR反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 50 s，56℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30个循环；72℃ 10 min。PCR产物由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果提交GenBank并构建系统发育树。
1.8 数据统计及分析
采用SPSS 18.0和ORIGIN 8.6软件对数据进行计算、整理；采用新复极差法，在0.05水平上分析差异显著性（P<0.05）。菌株16S rDNA序列通过DNAMAN 7.02和NCBI中的BLAST分析，用MEGA 6程序Neighbor-joining算法构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 芡实根际促生细菌的筛选
通过梯度稀释法涂布平板，加盖琼脂层模拟少氧环境，从芡实根际土壤共分离得到236个细菌分离物，经穿刺接种法反复筛选并纯化，得到17株能够快速生长的细菌。通过保绿法对这17株细菌进行初筛，共有Q6-2、Q11、Q67等10株细菌对小麦叶片的保绿效果较好。采用萝卜子叶增重法进一步验证其促生效果（表1），结果显示，接种菌株Q6-2和Q67的萝卜子叶增重率超过了300%，与对照相比，2株细菌对萝卜子叶的增重率分别提高59.26%和70.94%，具有良好的促生潜力。
2.2 菌株产植物激素及有机酸情况
产生植物激素刺激植物生长是PGPR重要的促生机制之一[16]，分泌植物激素含量的多少，是判定其促生效果强弱的重要指标。本文通过HPLC法定量检测了PGPR菌株Q6-2和Q67发酵液中植物激素的含量（表2）。结果显示，2株细菌均能够产生细胞分裂素ZT和KT，总量分别为4.36 mg/L和5.51 mg/L；菌株Q6-2还能够分泌生长素IAA；2株细菌发酵液中均未检测到GA和ABA。
某些细菌在代谢过程中会分泌有机酸，促进土壤难溶的磷、钾化合物的溶解，供给植物可以利用的营养成分[17]。有机酸HPLC测定结果显示，甲酸、乙酸、草酸、丙酸、丙二酸、柠檬酸和乳酸标准品分别在3.55、4.89、3.13、10.10、4.38、6.45、4.65 min出现吸收峰，丁二酸在7.21、8.28 min出现2个吸收峰，酒石酸在3.42、9.39 min出现2个吸收峰，苹果酸在4.06、8.20、7.38 min时出现3个吸收峰。根据出峰时间和峰形初步判断Q6-2发酵液中含有乳酸、丙酸、柠檬酸3种有机酸；Q67发酵液中含有甲酸、乳酸、丙酸和丁二酸4种有机酸。
2.3 PGPR对苗期芡实生长发育影响
芡实幼苗移栽40 d后，测定农艺性状及生物量等各项指标（表3）。结果显示，接种Q6-2后，芡实幼苗茎长、单株叶片数、最大叶面积、生物量（干重）分别比对照高出18.85%、40.67%、76.28%和37.50%，差异显著；接种Q67的芡实幼苗以上指标分别比对照高出27.47%、42.81%、96.05%和42.97%，差异显著。可见，根际细菌Q6-2和Q67对芡实幼苗的生长发育具有一定促进作用，Q67的促进效果略好于Q6-2，但二者间差异不显著。
2.4 PGPR对苗期芡实叶绿素及根系发育的影响
叶绿素含量和根系发育水平是判断植物生长发育水平的重要指标。移栽40 d后，对各处理芡实幼苗叶片的叶绿素含量以及根部干重、根冠比、根系活力等指标进行测定（表4）。结果表明，2株PGPR均有利于苗期芡实叶片中叶绿素的合成，接种Q6-2和Q67的处理叶片叶绿素含量分别比对照高出43.27%和51.46%，差异显著。此外， PGPR也促进了芡实幼苗根系的发育水平，接种Q6-2后，芡实幼苗的根部干重、根冠比和根系活力分别比对照高出52.50%、15.22%和5.41%；而接种Q67的处理，以上指标分别比对照高62.50%、21.74%和7.05%，根部干重和根系活力与对照间差异显著。Q67的促生效果略好Q6-2，但二者间差异不显著。 2.5 菌株鉴定
2.5.1 菌株形态特征及理化特性分析 Q6-2在NA培养基上生长24～48 h后，菌落呈白色，表面粗糙，非常干燥，不透明，边缘小锯齿状，中间点状突起，有褶皱，直径2～4 mm；镜检（1 000倍）菌体呈杆状，（1.5～3.0） μm×（0.6～0.8） μm，单生或集群，芽孢中生。Q67大部分形态特征与Q6-2相同，平板菌落一段时间后产生红色素，菌落直径3～5 mm，镜检下菌体大小约为（1.8～3.3） μm×（0.5～0.9） μm。
Q6-2的部分生理生化特性为：革兰氏阳性；接触酶、V-P试验、硝酸盐还原、淀粉水解、明胶液化阳性；M.R、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚试验阴性；葡萄糖产酸不产气；7% NaCl下可生长；生长温度为20～55℃。Q67大部分生理生化特性与Q6-2相同，只有M.R试验为阳性，生长温度范围15～55℃。
2.5.2 菌株的 16S rDNA序列分析 采用通用引物对菌株Q6-2和Q67的基因组DNA进行扩增，得到约1 440 bp的扩增片段，将序列提交 GenBank，获得登录号分别为KP686129和KP686133。将序列进行BLAST分析，选取相近种属的细菌构建系统发育树。结果如图1所示，2株细菌与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）下几株地衣芽孢杆菌聚为同一类群，Q6-2与Bacillus licheniformis CGMCC 2876 （GQ148817）和Bacillus licheniformis CICC 10181 （AY842871）的相似度均达到了97%；Q67与图中其余4株地衣芽孢杆菌的相似度均为99%。结合形态特征、理化特性及16S rDNA序列分析，将2株细菌鉴定为地衣芽孢杆菌。
3 讨论与结论
已有大量研究表明，接种PGPR能够促进植物生长、提高产量，如：Kumar等[18]通过浸种的方式接种Pseudomonas aeruginosa LES4，有效提高了芝麻产量，出油率和蛋白质含量比对照高出33.3%和47.5%；常文智等[19]接种Paenibacillus mucilaginosus 3016，将花生总产量提高了10.4%。也有研究表明，相比于从其他环境分离到的菌株，从某种植物根际筛选到PGPR菌株具有更好的环境适应性，可能对该种植物具有更好的应用效果[20]。由于水生植物根系环境与陆生植物差异较大，目前尚未有关于水生植物PGPR方面的报道，因此从芡实根际土壤有针对性地筛选促生细菌，是芡实微生物肥料研制过程中的关键环节。本文通过平板覆盖琼脂、穿刺法等模拟水田的少氧环境，从芡实根际土壤分离到17株在少氧条件下可以良好生长的细菌，并通过保绿法和萝卜子叶增重法进一步筛选到2株能够产生植物激素PGPR菌株Q6-2和Q67，经鉴定，2株细菌均为地衣芽孢杆菌。
研究表明，通过产生植物激素调节植物生长，是PGPR重要的促生机制之一[20]。HPLC结果显示，芡实根际细菌Q6-2和Q67能够产生ZT和KT，Q6-2还可以分泌IAA。ZT和KT是2种常见的细胞分裂素，不仅能够延缓叶片衰老，而且对植物生长具有促进作用[21，22]；IAA是一种生长素，一定浓度水平上可促进植物生根及地上部分的壮大[23]。与其他类似的研究相比，Q6-2和Q67产细胞分裂素的能力（4.36 mg/L和5.51 mg/L）高于Hussain等[24]筛选到的菌株Am3 （0.42 mg/L），Q6-2还能产生IAA，但产量低于陈波等[10]分离到的菌株AI5和PII17，2株细菌均不产生GA和ABA。试验中发现，2株细菌能分泌不同种类的有机酸，在促进土壤中难溶的磷、钾等化合物方面展现出一定的潜力。
盆栽试验结果表明，接菌处理幼苗的茎长、叶数、最大叶面积和生物量等指标全面优于对照，增长幅度在18.85%～96.05%之间。接种Q6-2和Q67也促进了幼苗叶绿素的合成和根系发育水平，其中叶绿素是反应植物光合作用强弱的重要指标，而苗期作物的根系发育对地上部分生长和后期发育起到至关重要的作用[25]，可见，2株细菌在促生方面展现出了良好的应用潜力，也可能存在着诱导植株系统抗性（ISR）的作用。虽然Q6-2和Q67同为地衣芽孢杆菌，但无论是农艺性状还是生理指标方面，Q67的作用效果均要好于Q6-2，这可能是由于2株细菌代谢产物不同造成的。
地衣芽孢杆菌在防病、促生方面的作用早有报道[26，27]，本研究首次探讨了其对水生作物的促生作用。地衣芽孢杆菌是一种兼性厌氧芽孢杆菌，相比于其他PGPR菌株，更适用于水田环境。因此，PGPR菌株Q6-2和Q67在开发芡实等水生作物微生物肥料方面具有巨大的应用潜力。由于细菌生长受到温度、水分、土壤理化性质等外界环境的影响较大，本研究的效果还有待在大田条件下加以验证，有关2株细菌的促生机制、产酶情况以及在芡实根际的定殖情况等也需要进一步研究。
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