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【中图分类号】R284.1 【文献标识码】A 【文章编号】1550-1868（2014）09
【摘要】摘要【目的】研究合成的姜黄素单羰基类似物在体外的稳定性及其抗胶质瘤细胞活性。【方法】将姜黄素及合成的化合物加入到反应介质中（不同pH的缓冲液、不同的生物介质），采用高效液相色谱法测定其浓度变化，采用动力学方法建立姜黄素类似物的降解速率方程。【结果】在相同条件下，姜黄素及合成化合物的稳定性依次为：A类≥C类≥B类≥姜黄素。【结论】合成的姜黄素单羰基类似物提高了体外稳定性，且优于先导物姜黄素。
【关键词】姜黄素；单羰基类似物；稳定性；高效液相色谱法
1 引言
姜黄素是从中药姜黄根茎中提取的一种黄色酸性酚类物质，是中药姜黄发挥药理作用的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、保肝、降血脂等多种药理作用[1]；近年来关于姜黄素药理作用方面的报道较多，但其在临床应用方面的报道却很少，究其原因是姜黄素稳定性差，在碱性溶液中易降解[2]、溶解度低、半衰期短等药代缺陷，限制了姜黄素在临床上的推广应用；姜黄素的不稳定是因其结构中含有不稳定的β-二酮基团（见图1）；因此，我们以提高稳定性、改善药代缺陷为前提，以姜黄素为先导物，设计合成了一种去除β-二酮基团的姜黄素单羰基类似物（见图2）；本文采用动力学方法，对合成的姜黄素单羰基类似物在不同pH的缓冲液、不同的生物介质中的降解速率常数进行了测定，并与相同条件下的姜黄素进行比较，对合成化合物的稳定性进行初步验证。
2 材料与方法
高效液相色谱仪（日本岛津公司，型号：LC-20）；Hypersil ODS2 C18（日本岛津公司，5μm×4.6 mm×200 mm）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-250DB）；电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型号：Seven Easy）；漩涡混合仪（苏州江东精密仪器有限公司，型号：XW-80A）；酸度计（瑞士METTLER TOLEDO公司，型号：AB265-S）色谱纯甲醇、色谱纯乙腈购自Fisher公司；1640培养基购自GIBICO公司、胎牛血清FBS购自Hyclone公司、人血浆取自医院健康自愿者采血、鼠血浆取自购买的健康SD大鼠。姜黄素对照品为国药集团上海化学试剂公司产品、姜黄素单羰基类似物A、B、C由温州医学院药学院梁广博士合成。其余试剂均为国产分析纯。
2.1缓冲溶液的配制 参照文献中的方法[3]配制，以磷酸二氢钠-氢氧化钠（pH=6.0、7.0）、碳酸-氢氧化钠（pH=8.0、9.0、10）为缓冲体系，缓冲溶液的浓度为0.1 mM，pH值分别为6.00、7.00、8.00、9.00、10.00的缓冲溶液，用酸度计进行校正。
2.2色谱条件
流动相 姜黄素：乙腈-水（体积比45：55），含1%（体积分数）乙酸；姜黄素类似物：乙腈-水（体积比70：30），含1%（体积分数）乙酸；检测波长：姜黄素420nm、姜黄素类似物A361nm；流速：1.0 mL.min-1；柱温：30℃；进样量为20μL；
在上述色谱条件下，进行HPLC分析。
2.3标准曲线的绘制
精密称取姜黄素及受测化合物A、B、C适量，加入甲醇溶液溶解并定容，配制终浓度为100 mg/mL的甲醇溶液，混匀，备用。分别精密吸取不同体积的姜黄素及受测化合物A、B、C的甲醇溶液，加入甲醇稀释，使其终浓度分别为：100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、5 μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL；過滤，取20μL进样，测定其色谱峰面积，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。
2.4缓冲溶液pH对姜黄素及化合物的A、B、C稳定性的影响
分别精密吸取配置好的姜黄素对照品及化合物A、B、C、5mM的甲醇溶液20μL，加入到980μL的不同pH的缓冲溶液中，37℃避光放置；定时取样，处理样品（取100μL混合液加入900μL的甲醇溶液定容，过滤），20μL进样，HPLC分析，分别测定其浓度，以lgC对时间t作图，为一直线，表明其降解为一级动力学过程。分别求出姜黄素及其类似物A、B、C在37℃不同pH条件下的降解速率方程、降解速率常数k、半衰期t1/2 。
2.5不同生物介质对姜黄素及化合物的A、B、C稳定性的影响
分别精密吸取配置好的姜黄素对照品及化合物A、B、C、5mM的甲醇溶液各20μL，加入980μL的不同生物介质中（0.1 M pH7.0磷酸盐溶液、1640细胞培养基、1640培养基+10%胎牛血清、鼠血浆、人血浆），37℃避光放置；定时取样，处理样品（前三个生物介质的处理方法同2.4所述；鼠血浆及人血浆的处理方法如下：取0.1mL混合液加入0.5mL乙酸乙酯/氯仿（9：1 v/v）处理液中，漩涡混匀，分离上层有机相，重复萃取一次，合并有机相，真空干燥，残渣加入100μL的甲醇溶解，过滤），取20μL进样，HPLC分析，分别测定其浓度，以时间为横坐标，浓度为纵坐标作图。
2.6体外抗肿瘤实验
实验使用MTT法测定姜黄素及合成化合物A、B、C对肿瘤细胞的抑制率，实验中选择了100mg.ml-1、10 mg.ml-1、1.0 mg.ml-1、0.1 mg.ml-1、0.01mg.ml-1五个浓度进行其抗肿瘤抑制试验，不同剂量的受测化合物A、B、C对肿瘤细胞呈现出不同程度的抑制率，且其抑制作用随着浓度的增高而逐渐增强，而且作用的时间越长，对肿瘤细胞的抑制作用也越强，对抗肿瘤作用较强的化合物B以及姜黄素对照样品通过流式细胞仪分析作用48h的细胞周期变化。
3 结果
A 姜黄素对照品色谱图 B 化合物A色谱图 C化合物B色谱图 D化合物C色谱图 3.1标准曲线的绘制：姜黄素的回归方程为：Y=285.9X-22.7，r =0.9994，在0.25-100μg/mL内，其线性关系良好；化合物A的回归方程为：Y=130.2X +24.6，r =0.9992，在0.25-100μg/mL 范围内，其线性关系良好；化合物B的回归方程为：Y=166.3X -47.5，r =0.9996，在0.25-100μg/mL 范围内，其线性关系良好；化合物C的回归方程为：Y=119.24X +65.6，r =0.9993，在0.25-100μg/mL范围内，其线性关系良好。
3.2缓冲溶液pH对姜黄素及化合物的A、B、C稳定性的影响
结果表明：姜黄素及化合物均随着缓冲溶液pH的升高，其降解速率明显加快；半衰期明显缩短，其中化合物A的稳定性较强，化合物B的稳定性较弱，三个化合物的稳定性均高于相同条件下的对照品姜黄素，初步证明去除不稳定β-二酮基团而使姜黄素单羰基类似物结构稳定的设计思路是正确的.分析结果详见表1。
3.3不同生物介质对姜黄素及化合物的A、B、C稳定性的影响
分析结果见图4（以0h的峰面积为100%计算）：姜黄素及合成物A、B、C在0.1 M pH7.0磷酸盐溶液、无血清的1640细胞培养基中降解较快，在含10%胎牛血清的1640细胞培养基、鼠血浆、人血浆中降解较慢；在相同条件下受测化合物的降解率均低于先导物姜黄素，进一步说明合成物具有比姜黄素更好的稳定性。
4 讨论
已有多篇文献报道[4，5，6]姜黄素在体外及溶液中表现出明显的不稳定性，尤其在中性、碱性条件下，在临床前、临床研究中表现出来的最大不足也是其药代学上的缺点，如半衰期短、血药浓度低、代谢过快、生物利用度低等；本实验研究了pH值及不同生物介质对姜黄素及合成化合物稳定性的影响，实验证实了姜黄素及化合物呈pH依赖性，在酸性溶液及中性溶液中较为稳定，碱性溶液中极不稳定，随着pH值的升高，其降解速率明显加快；同时，不同的生物介质对姜黄素及化合物的影响也是不同的，姜黄素在0.1 M pH7.0磷酸盐溶液、无血清的1640细胞培养基中降解较快，在含10%胎牛血清的1640细胞培养基、鼠血浆、人血浆中降解较慢，说明其在人体内吸收吸收较少，而合成化合物的降解均优于先导物姜黄素，其中化合物A在鼠血浆、人血浆的降解最低，可能是由于化合物B、化合物C与姜黄素在结构上的类似，而使其具有与姜黄素相近的稳定性，而化合物A可能是由于其中间连接链戊环产生位阻而使其稳定性增加，具体的机制还有待进一步研究。
本实验中其对肿瘤细胞的细胞周期的检测，发现姜黄素及化合物B都是G1期细胞增多，说明对细胞起到一定的抑制增殖作用，合成的化合物不僅具有优于先导物姜黄素的稳定性，且在改善其稳定性的同时，其抗肿瘤活性未发生改变，化合物A、B、C在实验中均显示出了较强的抗胶质瘤瘤活性，且化合物B的抗肿瘤活性优于阳性对照，并具有较好的剂量依赖性，剂量越高，其抗胶质瘤活性越好，作用时间越长，其抑制作用也越强；可能是由于化合物B、化合物C与姜黄素在结构上的类似，而使其具有较好的药理活性，而化合物A可能是由于其中间连接链戊环产生位阻而使其抗肿瘤活性降低，具体的抗肿瘤机制还有待进一步研究。其应用于临床还有很长一段路要走，希望不久的将来，姜黄素衍生物可以应用于临床，成为抗肿瘤的有效药品或者用于其他疾病的治疗，为人类造福！
[基金项目] 本课题由国家自然科学基金（grant no. ISIS584763SN：2810171） 和江苏省青蓝工程（53041305）的资助.
参考文献
[1]崔晶，翟光喜，娄红祥.姜黄素的研究进展[J].中南药学杂志，2005，3（2）：108-111.
[2]韩刚，霍文，李秋影，等.姜黄素的稳定性研究[J]，中成药，2007，29（2）：291-293.
[3]Wang YJ， Pan MH， Cheng Al. et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1997，15（12）：1867-1876.
[4]谭俊，蔡卓凡，王诗明.姜黄素制剂稳定性实验研究[J].中药材，2002， 25（8）：585-586.
[5]Sirima M，Wantana R， Shingo Y， et al. Preventive and curative effects of curcumin on the development of gastric inflammatory diseases in rats [J]. Journal of Natural Medicines，2006，60 （3）：191-197.
[6]Hsu CH，Cheng AL. Clinical studies with curcumin [J].Advances in Experimental Medicine and Biology，2007，595： 471-480.
【摘要】摘要【目的】研究合成的姜黄素单羰基类似物在体外的稳定性及其抗胶质瘤细胞活性。【方法】将姜黄素及合成的化合物加入到反应介质中（不同pH的缓冲液、不同的生物介质），采用高效液相色谱法测定其浓度变化，采用动力学方法建立姜黄素类似物的降解速率方程。【结果】在相同条件下，姜黄素及合成化合物的稳定性依次为：A类≥C类≥B类≥姜黄素。【结论】合成的姜黄素单羰基类似物提高了体外稳定性，且优于先导物姜黄素。
【关键词】姜黄素；单羰基类似物；稳定性；高效液相色谱法
1 引言
姜黄素是从中药姜黄根茎中提取的一种黄色酸性酚类物质，是中药姜黄发挥药理作用的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、保肝、降血脂等多种药理作用[1]；近年来关于姜黄素药理作用方面的报道较多，但其在临床应用方面的报道却很少，究其原因是姜黄素稳定性差，在碱性溶液中易降解[2]、溶解度低、半衰期短等药代缺陷，限制了姜黄素在临床上的推广应用；姜黄素的不稳定是因其结构中含有不稳定的β-二酮基团（见图1）；因此，我们以提高稳定性、改善药代缺陷为前提，以姜黄素为先导物，设计合成了一种去除β-二酮基团的姜黄素单羰基类似物（见图2）；本文采用动力学方法，对合成的姜黄素单羰基类似物在不同pH的缓冲液、不同的生物介质中的降解速率常数进行了测定，并与相同条件下的姜黄素进行比较，对合成化合物的稳定性进行初步验证。
2 材料与方法
高效液相色谱仪（日本岛津公司，型号：LC-20）；Hypersil ODS2 C18（日本岛津公司，5μm×4.6 mm×200 mm）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-250DB）；电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型号：Seven Easy）；漩涡混合仪（苏州江东精密仪器有限公司，型号：XW-80A）；酸度计（瑞士METTLER TOLEDO公司，型号：AB265-S）色谱纯甲醇、色谱纯乙腈购自Fisher公司；1640培养基购自GIBICO公司、胎牛血清FBS购自Hyclone公司、人血浆取自医院健康自愿者采血、鼠血浆取自购买的健康SD大鼠。姜黄素对照品为国药集团上海化学试剂公司产品、姜黄素单羰基类似物A、B、C由温州医学院药学院梁广博士合成。其余试剂均为国产分析纯。
2.1缓冲溶液的配制 参照文献中的方法[3]配制，以磷酸二氢钠-氢氧化钠（pH=6.0、7.0）、碳酸-氢氧化钠（pH=8.0、9.0、10）为缓冲体系，缓冲溶液的浓度为0.1 mM，pH值分别为6.00、7.00、8.00、9.00、10.00的缓冲溶液，用酸度计进行校正。
2.2色谱条件
流动相 姜黄素：乙腈-水（体积比45：55），含1%（体积分数）乙酸；姜黄素类似物：乙腈-水（体积比70：30），含1%（体积分数）乙酸；检测波长：姜黄素420nm、姜黄素类似物A361nm；流速：1.0 mL.min-1；柱温：30℃；进样量为20μL；
在上述色谱条件下，进行HPLC分析。
2.3标准曲线的绘制
精密称取姜黄素及受测化合物A、B、C适量，加入甲醇溶液溶解并定容，配制终浓度为100 mg/mL的甲醇溶液，混匀，备用。分别精密吸取不同体积的姜黄素及受测化合物A、B、C的甲醇溶液，加入甲醇稀释，使其终浓度分别为：100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、5 μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL；過滤，取20μL进样，测定其色谱峰面积，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。
2.4缓冲溶液pH对姜黄素及化合物的A、B、C稳定性的影响
分别精密吸取配置好的姜黄素对照品及化合物A、B、C、5mM的甲醇溶液20μL，加入到980μL的不同pH的缓冲溶液中，37℃避光放置；定时取样，处理样品（取100μL混合液加入900μL的甲醇溶液定容，过滤），20μL进样，HPLC分析，分别测定其浓度，以lgC对时间t作图，为一直线，表明其降解为一级动力学过程。分别求出姜黄素及其类似物A、B、C在37℃不同pH条件下的降解速率方程、降解速率常数k、半衰期t1/2 。
2.5不同生物介质对姜黄素及化合物的A、B、C稳定性的影响
分别精密吸取配置好的姜黄素对照品及化合物A、B、C、5mM的甲醇溶液各20μL，加入980μL的不同生物介质中（0.1 M pH7.0磷酸盐溶液、1640细胞培养基、1640培养基+10%胎牛血清、鼠血浆、人血浆），37℃避光放置；定时取样，处理样品（前三个生物介质的处理方法同2.4所述；鼠血浆及人血浆的处理方法如下：取0.1mL混合液加入0.5mL乙酸乙酯/氯仿（9：1 v/v）处理液中，漩涡混匀，分离上层有机相，重复萃取一次，合并有机相，真空干燥，残渣加入100μL的甲醇溶解，过滤），取20μL进样，HPLC分析，分别测定其浓度，以时间为横坐标，浓度为纵坐标作图。
2.6体外抗肿瘤实验
实验使用MTT法测定姜黄素及合成化合物A、B、C对肿瘤细胞的抑制率，实验中选择了100mg.ml-1、10 mg.ml-1、1.0 mg.ml-1、0.1 mg.ml-1、0.01mg.ml-1五个浓度进行其抗肿瘤抑制试验，不同剂量的受测化合物A、B、C对肿瘤细胞呈现出不同程度的抑制率，且其抑制作用随着浓度的增高而逐渐增强，而且作用的时间越长，对肿瘤细胞的抑制作用也越强，对抗肿瘤作用较强的化合物B以及姜黄素对照样品通过流式细胞仪分析作用48h的细胞周期变化。
3 结果
A 姜黄素对照品色谱图 B 化合物A色谱图 C化合物B色谱图 D化合物C色谱图 3.1标准曲线的绘制：姜黄素的回归方程为：Y=285.9X-22.7，r =0.9994，在0.25-100μg/mL内，其线性关系良好；化合物A的回归方程为：Y=130.2X +24.6，r =0.9992，在0.25-100μg/mL 范围内，其线性关系良好；化合物B的回归方程为：Y=166.3X -47.5，r =0.9996，在0.25-100μg/mL 范围内，其线性关系良好；化合物C的回归方程为：Y=119.24X +65.6，r =0.9993，在0.25-100μg/mL范围内，其线性关系良好。
3.2缓冲溶液pH对姜黄素及化合物的A、B、C稳定性的影响
结果表明：姜黄素及化合物均随着缓冲溶液pH的升高，其降解速率明显加快；半衰期明显缩短，其中化合物A的稳定性较强，化合物B的稳定性较弱，三个化合物的稳定性均高于相同条件下的对照品姜黄素，初步证明去除不稳定β-二酮基团而使姜黄素单羰基类似物结构稳定的设计思路是正确的.分析结果详见表1。
3.3不同生物介质对姜黄素及化合物的A、B、C稳定性的影响
分析结果见图4（以0h的峰面积为100%计算）：姜黄素及合成物A、B、C在0.1 M pH7.0磷酸盐溶液、无血清的1640细胞培养基中降解较快，在含10%胎牛血清的1640细胞培养基、鼠血浆、人血浆中降解较慢；在相同条件下受测化合物的降解率均低于先导物姜黄素，进一步说明合成物具有比姜黄素更好的稳定性。
4 讨论
已有多篇文献报道[4，5，6]姜黄素在体外及溶液中表现出明显的不稳定性，尤其在中性、碱性条件下，在临床前、临床研究中表现出来的最大不足也是其药代学上的缺点，如半衰期短、血药浓度低、代谢过快、生物利用度低等；本实验研究了pH值及不同生物介质对姜黄素及合成化合物稳定性的影响，实验证实了姜黄素及化合物呈pH依赖性，在酸性溶液及中性溶液中较为稳定，碱性溶液中极不稳定，随着pH值的升高，其降解速率明显加快；同时，不同的生物介质对姜黄素及化合物的影响也是不同的，姜黄素在0.1 M pH7.0磷酸盐溶液、无血清的1640细胞培养基中降解较快，在含10%胎牛血清的1640细胞培养基、鼠血浆、人血浆中降解较慢，说明其在人体内吸收吸收较少，而合成化合物的降解均优于先导物姜黄素，其中化合物A在鼠血浆、人血浆的降解最低，可能是由于化合物B、化合物C与姜黄素在结构上的类似，而使其具有与姜黄素相近的稳定性，而化合物A可能是由于其中间连接链戊环产生位阻而使其稳定性增加，具体的机制还有待进一步研究。
本实验中其对肿瘤细胞的细胞周期的检测，发现姜黄素及化合物B都是G1期细胞增多，说明对细胞起到一定的抑制增殖作用，合成的化合物不僅具有优于先导物姜黄素的稳定性，且在改善其稳定性的同时，其抗肿瘤活性未发生改变，化合物A、B、C在实验中均显示出了较强的抗胶质瘤瘤活性，且化合物B的抗肿瘤活性优于阳性对照，并具有较好的剂量依赖性，剂量越高，其抗胶质瘤活性越好，作用时间越长，其抑制作用也越强；可能是由于化合物B、化合物C与姜黄素在结构上的类似，而使其具有较好的药理活性，而化合物A可能是由于其中间连接链戊环产生位阻而使其抗肿瘤活性降低，具体的抗肿瘤机制还有待进一步研究。其应用于临床还有很长一段路要走，希望不久的将来，姜黄素衍生物可以应用于临床，成为抗肿瘤的有效药品或者用于其他疾病的治疗，为人类造福！
[基金项目] 本课题由国家自然科学基金（grant no. ISIS584763SN：2810171） 和江苏省青蓝工程（53041305）的资助.
参考文献
[1]崔晶，翟光喜，娄红祥.姜黄素的研究进展[J].中南药学杂志，2005，3（2）：108-111.
[2]韩刚，霍文，李秋影，等.姜黄素的稳定性研究[J]，中成药，2007，29（2）：291-293.
[3]Wang YJ， Pan MH， Cheng Al. et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1997，15（12）：1867-1876.
[4]谭俊，蔡卓凡，王诗明.姜黄素制剂稳定性实验研究[J].中药材，2002， 25（8）：585-586.
[5]Sirima M，Wantana R， Shingo Y， et al. Preventive and curative effects of curcumin on the development of gastric inflammatory diseases in rats [J]. Journal of Natural Medicines，2006，60 （3）：191-197.
[6]Hsu CH，Cheng AL. Clinical studies with curcumin [J].Advances in Experimental Medicine and Biology，2007，595： 471-480.