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【摘要】 目的：探究在应用荧光定量PCR检测血清HBV DNA中出现的问题，并制定对应的处理方法。方法：对本院2010年-2012年本院实验室送检应用荧光定量PCR检测的血标本HBV DNA中出现的疑难问题进行回顾性分析，另外采用不同试剂对所出现的问题进行复查；对比检查结果的各种比例，对两种结果出现不一致的因素进行分析。结果：本次结果2010年-2012年出现疑难结果的标本共有1968例，总平均复查了达到1.71%；两次结果保持一致的例数有1585例，而不一致的结果有343例；造成结果不一致主要是因为以下因素的影响：试剂因素与试剂外因素；而其中试剂因素的影响更为明显，且呈现出逐年升高的趋势。结论：对血HBV DNA定量检测当中的疑难结果应用不同试剂复查，能够最大程度防止血HBV DNA定量检测的漏检率，提高检验质量，更有利于对乙肝患者进行临床抗病毒指导。
【关键词】 血HBV DNA定量检测疑难结果分析对策
【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1671-5160(2014)02-0238-02 随着人们生活节奏加快以及饮食结构发生变化，很多疾病都呈现出逐渐多发的趋势，其中乙肝疾病对人们的身体健康以及生活质量造成了严重的影响。在临床上对乙肝患者体内病毒的检测方法主要是乙型肝炎病毒DNA（HBV DNA）定量检测，而当前最为普遍的检测方法则是实时荧光定量PCR检测方法，本身的检测结果准确性相对较高，而这和其引物还有探针有着直接联系。而患者接受抗病毒药物的治疗会导致本身HBV经受不住药物压力而出现基因突变，因此对HBV DNA的定量检测准确性产生负面影响，对于临床治疗方案指导以及患者而言都是一种挑战[1]。为了深入探究血HBV DNA定量检测中的疑难结果，并根据分析的结果制定对应措施，对本院2010年-2012年血HBV DNA定量检测所发现的疑难结果进行回顾性分析。现总结如下。
1 资料与方法
1.1标本来源
选自本院2010年-2012年来自门诊、住院以及体检的HBV DNA定量筛查血标本。对于接受筛查的HBV DNA标本均在当天之内完成相关检测。以疑难结果为根据应用对应的复查规则，如果标本需要接受复查则在隔天和当天需检测的标本一起接受测定，对所有复查标本数据以回顾性的方法进行分析。
1.1.1标本的采集与处理
对患者应用普通采血管进行静脉血液采集，抽取血液3毫升并在37℃环境下放置1个小时，带盖进行2分钟的3000rpm离心。标本可以立即进行测试，可能够在温度为-20℃的环境下保存等待测试，保存期为6个月。
1.1.2PCR试剂准备
以SOP的相关规定进入到试剂准备区域并填写日常登记表格。计算好标本数、标准品数量、阴性参照、临界值参照、室内质控品以及空白对照数等，在冰箱里面将需要使用的试剂取出，单人单管，填写完流程表之后将其放入传递窗。根据SOP的相关规定进行清洁消毒以及消灭医疗废品等操作。
1.2血HBV DNA定量检测
本次研究检测使用仪器是MX3000P，试剂为达安；对待测标本和质控标本两者一同进行处理，质控标本主要有以下几种：阴性对照、低值质控还有高值质控等，其中高值质控参照国家关于HBV DNA的标准物质规定；在剂量为100ul的血清当中提取HBV DNA，提取方法为煮沸裂解法，经过相关处理后得到体积为20ul；提取剂量为2ul的作为扩增模板。
完成扩增之后以试剂盒附带的相关说明说对结果分析条件诸如阈值还有基线等进行参数设定；试剂盒最低的检出限是每毫升500IU；根据本次试验具体要求，对新旧批号两种试剂之间进行简单的EP9-A对比。
循环参数设定如下：
1.3 HBV DNA疑难结果复查规则
对报告单进行审核的时候应该特别谨慎，对出现何种情况则归类到疑难结果要详细分类，对出现疑难结果的标本在隔天进行复查，并做好复查的标本登记，登记内容主要有：患者一般资料、复查原因、复查结果还有审核人姓名。本次研究当审核中发现以下情况，则归类为疑难结果[2]：（1）乙肝出现“两对半”的情况，其中为全阴性或者HBsAg阴性，同时血HBV DNA出现定量结果的标本；（2）结果显示ALT在正常范围内，含有HBsAg阳性还有HBeAg运行的所有乙肝表现出“两对半”的模式，同时HBV DNA定量结果显示每毫升超过106IU的标本；（3）含有HBsAg阳性还有HBeAg阳性的乙肝均呈现出了“两对半”的模式，另外受检患者经询问后并无抗病毒治疗史，HBV DNA定量相对于检测限要低很多；（5）血HBV DNA两次的历史变化在3个对数级（LOG）以上的标本；（6）HBsAg阳性均呈现出了“两对半”的模式，另外实时荧光PCR扩增曲线有异常表现，诸如扩增曲线不光滑并且有扩增效率下降的趋势；（7）HBV DNA相对于检测限要低很多，而HBV DNA结果和临床诊断有冲突或者变化较为明显。
1.4 HBV DNA定量分析的质量控制
本次研究的所有实验操作均在本院临床基因扩增实验室里面进行，而试剂配制、PCR扩增还有加样等操作则在不同的区域内；每一批PCR均有阴性对照，低值质控以及高值质控，阴性对照则没有扩增曲线的设置，低值质控还有高值质控需要在室内的控制范围之内，才能够认为这批次的结果为有效。
1.5结果统计
进行两种不同试剂之间的对比，根据NCCLS EP9-A2进行相关检验；将本院2010年-2012年HBV DNA疑难结果复查所得资料输入Excel表格，对复查的总例数、平均复查率等进行统计，对两次结果的一致性和不一致性例数进行计算。
2 结果
本次结果2010年-2012年出现疑难结果的标本共有1968例，总平均复查了达到1.71%；两次结果保持一致的例数有1585例，而不一致的结果有343例。
本次研究中，两种不同的试剂盒检测结果进行EP9-A2的方法对比，范围设置在（103-108）之间，对其在线性回归方程进行计算，得到标准差为0.13，从本次检测结果中可知两种试剂之间检测结果并不存在显著性差异。
对疑难结果进行检验复查之后的FQ-PCR扩增曲线对比，正常阳性标本的基线平坦，而阳性标本的拐点相对于标准品要更加明显，而在平台期两者之间的峰值没有太大的差别，曲线之间的平行度良好，两者的标准曲线相关系数＞0.99，跟试剂盒复述说明书的结果判断没有明显差异；部分正是为假阴性的可疑标本，并没有出现阳性扩增曲线，曲线相对平坦，而荧光变化的幅度不大，验证复查之后有阳性扩增出现，曲线抬高幅度明显，荧光变化幅度显著；证实为扩增效率低下，此类标本曲线上抬，但是荧光变化幅度并不显著，经过验证复查之后有阳性扩增现象出现，曲线抬高，荧光变化幅度更为明显，曲线的平行度和正常标本并无太大分别。
造成结果不一致主要是因为以下因素的影响：试剂因素与试剂外因素，试剂因素主要有无扩增曲线导致的假阴性现象以及有扩增曲线但是效率低下，试剂外因素主要是操作污染；而其中试剂因素的影响更为明显，且呈现出逐年升高的趋势。
3 讨论
血HBV DNA定量检测在临床上得到了极为广泛的应用，且该方法的临床价值随着应用的深入越来越重要，通过该检测方法，能够对乙肝病毒携带者进行临床诊断，更好的了解乙肝患者体内病毒的变化状况，根据检测结果医生可以更有针对性的制定抗病毒治疗方案，同时也能够判定病毒药物的临床效果。
有国外研究对血HBV DNA定量测量结果通过FQ-PCR方法来检测，将PCR的灵敏性还有荧光探针杂交特异性进行科学的结合，对血清当中的HBV DNA进行更加准确的定量[3]。随着抗病毒核苷类药物的应用呈现出泛滥的趋势，很多慢性乙肝患者在接受抗病毒治疗中肝功能指标出现异常，HBV DNA结果显示低于检测限，这都表示患者均非真正将病毒清除。
本次研究中制定了复查的策略，对出现的疑难结果进行更加严谨科学的检查，同时探究造成疑难结果的主要原因。本次研究中如果两次检查结果相一致，则以第一次检查结果为标准，如存在不同则以第二次检查结果为准。
综上所述，对血HBV DNA定量检测当中的疑难结果应用不同试剂复查，能够最大程度防止血HBV DNA定量检测的漏检率，避免因为试剂原因或者非试剂原因导致的检查误差，提高检验质量，更有利于对乙肝患者进行临床抗病毒指导。
参考文献
[1] 张正国.乙肝病毒血清标志物与HBV DNA定量检测的相关性分析[J]. 中国现代医生. 2012，12(19)：119-120
[2] 邓少丽,罗阳.荧光定量PCR技术及其在临床上的应用[J]. 国外医学.临床生物化学与检验学分册. 2012，17(05)：185-186
[3] Fung J,Seto W K,Lai C L, et al.Profiles of HBV DNA in a largepopulation of Chinese patients with chronic hepatitis B: implications forantiviral therapy. Journal of Hepatology . 2011，14（22）：154-155
【关键词】 血HBV DNA定量检测疑难结果分析对策
【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1671-5160(2014)02-0238-02 随着人们生活节奏加快以及饮食结构发生变化，很多疾病都呈现出逐渐多发的趋势，其中乙肝疾病对人们的身体健康以及生活质量造成了严重的影响。在临床上对乙肝患者体内病毒的检测方法主要是乙型肝炎病毒DNA（HBV DNA）定量检测，而当前最为普遍的检测方法则是实时荧光定量PCR检测方法，本身的检测结果准确性相对较高，而这和其引物还有探针有着直接联系。而患者接受抗病毒药物的治疗会导致本身HBV经受不住药物压力而出现基因突变，因此对HBV DNA的定量检测准确性产生负面影响，对于临床治疗方案指导以及患者而言都是一种挑战[1]。为了深入探究血HBV DNA定量检测中的疑难结果，并根据分析的结果制定对应措施，对本院2010年-2012年血HBV DNA定量检测所发现的疑难结果进行回顾性分析。现总结如下。
1 资料与方法
1.1标本来源
选自本院2010年-2012年来自门诊、住院以及体检的HBV DNA定量筛查血标本。对于接受筛查的HBV DNA标本均在当天之内完成相关检测。以疑难结果为根据应用对应的复查规则，如果标本需要接受复查则在隔天和当天需检测的标本一起接受测定，对所有复查标本数据以回顾性的方法进行分析。
1.1.1标本的采集与处理
对患者应用普通采血管进行静脉血液采集，抽取血液3毫升并在37℃环境下放置1个小时，带盖进行2分钟的3000rpm离心。标本可以立即进行测试，可能够在温度为-20℃的环境下保存等待测试，保存期为6个月。
1.1.2PCR试剂准备
以SOP的相关规定进入到试剂准备区域并填写日常登记表格。计算好标本数、标准品数量、阴性参照、临界值参照、室内质控品以及空白对照数等，在冰箱里面将需要使用的试剂取出，单人单管，填写完流程表之后将其放入传递窗。根据SOP的相关规定进行清洁消毒以及消灭医疗废品等操作。
1.2血HBV DNA定量检测
本次研究检测使用仪器是MX3000P，试剂为达安；对待测标本和质控标本两者一同进行处理，质控标本主要有以下几种：阴性对照、低值质控还有高值质控等，其中高值质控参照国家关于HBV DNA的标准物质规定；在剂量为100ul的血清当中提取HBV DNA，提取方法为煮沸裂解法，经过相关处理后得到体积为20ul；提取剂量为2ul的作为扩增模板。
完成扩增之后以试剂盒附带的相关说明说对结果分析条件诸如阈值还有基线等进行参数设定；试剂盒最低的检出限是每毫升500IU；根据本次试验具体要求，对新旧批号两种试剂之间进行简单的EP9-A对比。
循环参数设定如下：
1.3 HBV DNA疑难结果复查规则
对报告单进行审核的时候应该特别谨慎，对出现何种情况则归类到疑难结果要详细分类，对出现疑难结果的标本在隔天进行复查，并做好复查的标本登记，登记内容主要有：患者一般资料、复查原因、复查结果还有审核人姓名。本次研究当审核中发现以下情况，则归类为疑难结果[2]：（1）乙肝出现“两对半”的情况，其中为全阴性或者HBsAg阴性，同时血HBV DNA出现定量结果的标本；（2）结果显示ALT在正常范围内，含有HBsAg阳性还有HBeAg运行的所有乙肝表现出“两对半”的模式，同时HBV DNA定量结果显示每毫升超过106IU的标本；（3）含有HBsAg阳性还有HBeAg阳性的乙肝均呈现出了“两对半”的模式，另外受检患者经询问后并无抗病毒治疗史，HBV DNA定量相对于检测限要低很多；（5）血HBV DNA两次的历史变化在3个对数级（LOG）以上的标本；（6）HBsAg阳性均呈现出了“两对半”的模式，另外实时荧光PCR扩增曲线有异常表现，诸如扩增曲线不光滑并且有扩增效率下降的趋势；（7）HBV DNA相对于检测限要低很多，而HBV DNA结果和临床诊断有冲突或者变化较为明显。
1.4 HBV DNA定量分析的质量控制
本次研究的所有实验操作均在本院临床基因扩增实验室里面进行，而试剂配制、PCR扩增还有加样等操作则在不同的区域内；每一批PCR均有阴性对照，低值质控以及高值质控，阴性对照则没有扩增曲线的设置，低值质控还有高值质控需要在室内的控制范围之内，才能够认为这批次的结果为有效。
1.5结果统计
进行两种不同试剂之间的对比，根据NCCLS EP9-A2进行相关检验；将本院2010年-2012年HBV DNA疑难结果复查所得资料输入Excel表格，对复查的总例数、平均复查率等进行统计，对两次结果的一致性和不一致性例数进行计算。
2 结果
本次结果2010年-2012年出现疑难结果的标本共有1968例，总平均复查了达到1.71%；两次结果保持一致的例数有1585例，而不一致的结果有343例。
本次研究中，两种不同的试剂盒检测结果进行EP9-A2的方法对比，范围设置在（103-108）之间，对其在线性回归方程进行计算，得到标准差为0.13，从本次检测结果中可知两种试剂之间检测结果并不存在显著性差异。
对疑难结果进行检验复查之后的FQ-PCR扩增曲线对比，正常阳性标本的基线平坦，而阳性标本的拐点相对于标准品要更加明显，而在平台期两者之间的峰值没有太大的差别，曲线之间的平行度良好，两者的标准曲线相关系数＞0.99，跟试剂盒复述说明书的结果判断没有明显差异；部分正是为假阴性的可疑标本，并没有出现阳性扩增曲线，曲线相对平坦，而荧光变化的幅度不大，验证复查之后有阳性扩增出现，曲线抬高幅度明显，荧光变化幅度显著；证实为扩增效率低下，此类标本曲线上抬，但是荧光变化幅度并不显著，经过验证复查之后有阳性扩增现象出现，曲线抬高，荧光变化幅度更为明显，曲线的平行度和正常标本并无太大分别。
造成结果不一致主要是因为以下因素的影响：试剂因素与试剂外因素，试剂因素主要有无扩增曲线导致的假阴性现象以及有扩增曲线但是效率低下，试剂外因素主要是操作污染；而其中试剂因素的影响更为明显，且呈现出逐年升高的趋势。
3 讨论
血HBV DNA定量检测在临床上得到了极为广泛的应用，且该方法的临床价值随着应用的深入越来越重要，通过该检测方法，能够对乙肝病毒携带者进行临床诊断，更好的了解乙肝患者体内病毒的变化状况，根据检测结果医生可以更有针对性的制定抗病毒治疗方案，同时也能够判定病毒药物的临床效果。
有国外研究对血HBV DNA定量测量结果通过FQ-PCR方法来检测，将PCR的灵敏性还有荧光探针杂交特异性进行科学的结合，对血清当中的HBV DNA进行更加准确的定量[3]。随着抗病毒核苷类药物的应用呈现出泛滥的趋势，很多慢性乙肝患者在接受抗病毒治疗中肝功能指标出现异常，HBV DNA结果显示低于检测限，这都表示患者均非真正将病毒清除。
本次研究中制定了复查的策略，对出现的疑难结果进行更加严谨科学的检查，同时探究造成疑难结果的主要原因。本次研究中如果两次检查结果相一致，则以第一次检查结果为标准，如存在不同则以第二次检查结果为准。
综上所述，对血HBV DNA定量检测当中的疑难结果应用不同试剂复查，能够最大程度防止血HBV DNA定量检测的漏检率，避免因为试剂原因或者非试剂原因导致的检查误差，提高检验质量，更有利于对乙肝患者进行临床抗病毒指导。
参考文献
[1] 张正国.乙肝病毒血清标志物与HBV DNA定量检测的相关性分析[J]. 中国现代医生. 2012，12(19)：119-120
[2] 邓少丽,罗阳.荧光定量PCR技术及其在临床上的应用[J]. 国外医学.临床生物化学与检验学分册. 2012，17(05)：185-186
[3] Fung J,Seto W K,Lai C L, et al.Profiles of HBV DNA in a largepopulation of Chinese patients with chronic hepatitis B: implications forantiviral therapy. Journal of Hepatology . 2011，14（22）：154-155